棘胸蛙肌肉營養(yǎng)成分季節(jié)變化分析與評(píng)價(jià)

劉芳彬，王 偉，黃永春, ，楊漢民

（1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021；2.龍巖市上茶亭生態(tài)養(yǎng)殖有限公司，福建 龍巖 364000）

棘胸蛙（Quasipaa spinosa）屬脊索動(dòng)物門（Chordata）、兩棲綱（Amphibia）、無尾目（Anura）、蛙科（Ranidae）、棘蛙屬（Rana），俗稱石凍和石蛙等，是中國南方特有的大型經(jīng)濟(jì)蛙類[1]。棘胸蛙具有較高的食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，作為特種養(yǎng)殖的品種之一，自20世紀(jì)80年代起，福建、江西等地就開始嘗試人工馴養(yǎng)[2]。當(dāng)前棘胸蛙的總體養(yǎng)殖規(guī)模較小，主要以個(gè)體養(yǎng)殖戶為主。產(chǎn)品結(jié)構(gòu)單一，主要以銷售成品蛙為主，缺乏對(duì)于棘胸蛙產(chǎn)品的開發(fā)和深加工的深入研究，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值還有待進(jìn)一步的挖掘。

當(dāng)前研究主要集中在不同部位、不同的生長階段對(duì)棘胸蛙的營養(yǎng)組成方面的研究。舒妙安[3?4]研究不同生長階段棘胸蛙的肌肉營養(yǎng)成分，其肌肉中的蛋白質(zhì)含量在18.55%～19.39%；毛劍婷等[5]對(duì)棘胸蛙蝌蚪在不同飼料搭配投喂下的變態(tài)發(fā)育情況進(jìn)行了研究，結(jié)果表明青飼料配合中華鱉配合飼料進(jìn)行投喂可以提高其變態(tài)率；謝永廣等[6]研究了不同飼料水平及投喂頻率下的棘胸蛙蝌蚪生長情況，結(jié)果表明在飼料含39%蛋白，日投喂2次情況下，其蝌蚪具有較好的生長速度和變態(tài)規(guī)整性。綜上，棘胸蛙的肉質(zhì)品質(zhì)受到多種因素的影響，同時(shí)蛙類作為變溫動(dòng)物，對(duì)氣候變化會(huì)更為敏感[7]，不同季節(jié)的水溫和氣溫等環(huán)境因素的變化都可能造成其肌肉營養(yǎng)成分的差異，但目前關(guān)于季節(jié)變化對(duì)于棘胸蛙肌肉營養(yǎng)成分的影響的研究尚未見報(bào)道。因此本文對(duì)棘胸蛙不同季節(jié)的常規(guī)營養(yǎng)成分、氨基酸組成、脂肪酸組成進(jìn)行分析比較，旨在為棘胸蛙的相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)與深加工提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棘胸蛙 福建龍巖上茶亭生態(tài)養(yǎng)殖有限公司；不同季節(jié)投喂餌料均為黃粉蟲，樣品分別采集于2019年1月冬季，體長（94.88±6.13）mm，體重（104.19±12.96）g；2020年5月春季，體長（99.41±5.93）mm，體重（117.45±13.05）g；2020年8月夏季，體長（94.99±4.98）mm，體重（108.12±10.99）g和2020年11月秋季，體長（96.62±3.84）mm，體重（111.33±10.81）g，四個(gè)季節(jié)均選取同一批次投放的二齡成蛙，每次采集12只，雌雄比例為1:1；異辛烷、鹽酸、檸檬酸鈉、氫氧化鉀、氯化鈉 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醚、甲醇 分析純，西隴科學(xué)股份有限公司。

FD-1A-50真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏公司；Kjeltec-8400全自動(dòng)凱氏定氮儀 丹麥FOSS公司；L-8800氨基酸自動(dòng)分析儀、GC-2010氣相色譜儀日本島津公司；B180馬弗爐 德國納博熱公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海科升公司；HH-2A恒溫水浴鍋 上海梅香儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 雙毀髓法處理后，從軀干與后肢連接處剪下后肢，剝離皮膚與骨骼，取下肌肉，將肌肉剪成小塊混合后分為兩份，一份保存于?20 ℃冰箱，用于常規(guī)營養(yǎng)成分的測(cè)定，一份經(jīng)冷凍干燥后用于氨基酸和脂肪酸組成的測(cè)定[8]。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定 水分采用105 ℃烘箱干燥恒重法測(cè)定[9]，粗脂肪采用索氏提取法測(cè)定[10]，灰分采用馬弗爐灼燒法測(cè)定[11]，粗蛋白質(zhì)采用凱氏定氮法測(cè)定[12]。

氨基酸采用鹽酸水解法測(cè)定[13]，將凍干后的樣品粉碎后稱取放入水解管中，加入15 mL 6 mol/L的鹽酸溶液，然后抽真空密封水解瓶置于（110±1）℃干燥箱中，水解22 h后，取1 mL減壓干燥，用檸檬酸鈉溶液溶解過濾后采樣氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定。

脂肪酸采用氣相色譜法測(cè)定[14]，將凍干樣品粉碎后經(jīng)過索氏提取后，取適量提取物，加入4 mL異辛烷，混勻后加入0.5 mL 2%氫氧化鉀甲醇溶液，振蕩混勻，皂化2 h，加入正己烷（氯化鈉飽和），取上清液待測(cè)定。

1.2.3 必需氨基酸組成評(píng)價(jià)方法 以FAO/WHO的氨基酸評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)模式進(jìn)行評(píng)價(jià)，并按下列公式計(jì)算氨基酸評(píng)分（AAS）、化學(xué)評(píng)分（CS）和必需氨基酸指數(shù)（EAAI）。

式中：EAAI中n表示必需氨基酸個(gè)數(shù)；AAS和CS中mg/g·N表示每克氮中氨基酸的毫克數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。數(shù)據(jù)用Excel 2013軟件整理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，在單因素方差分析（ANOVA）基礎(chǔ)上采用LSD多重比較法進(jìn)行分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）來表示，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同季節(jié)棘胸蛙肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分分析

棘胸蛙肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分的季節(jié)變化情況如表1所示。不同季節(jié)水分含量大小依次為秋季、春季、夏季和冬季，其中秋季和春季肌肉的水分含量顯著高于夏季和冬季（P<0.05）；不同季節(jié)粗蛋白含量大小依次為冬季、夏季、春季和秋季，冬季肌肉的粗蛋白含量顯著高于其余三個(gè)季節(jié)（P<0.05）；不同季節(jié)粗脂肪含量大小依次為冬季、夏季、秋季和春季，冬季肌肉粗脂肪含量顯著高于其它三個(gè)季節(jié)（P<0.05）；不同季節(jié)灰分大小依次為秋季、夏季、冬季和春季，秋季肌肉灰分含量顯著高于其它三個(gè)季節(jié)（P<0.05）。四種常規(guī)營養(yǎng)成分中粗蛋白和粗脂肪含量的季節(jié)變化較大并且變化規(guī)律相似。可能與棘胸蛙在不同季節(jié)的攝食強(qiáng)度有關(guān)。

表1 棘胸蛙肌肉常規(guī)營養(yǎng)成分變化情況（濕重g/100 g）Table 1 Changes of basic nutrient composition in muscle of Quasipaa spinosa (wet weight g/100 g)

2.2 不同季節(jié)棘胸蛙肌肉氨基酸組成分析

棘胸蛙肌肉的氨基酸組成季節(jié)變化情況如表2所示，棘胸蛙的氨基酸組成種類并未受到季節(jié)變化的影響。在不同季節(jié)棘胸蛙肌肉中均檢測(cè)出17種氨基酸，其中必需氨基酸為7種，鮮味氨基酸為4種。不同季節(jié)肌肉氨基酸組成中均是谷氨酸含量最高，胱氨酸含量最低。不同季節(jié)棘胸蛙肌肉中氨基酸總量大小依次為秋季>春季>冬季>夏季；不同季節(jié)肌肉中必需氨基酸含量大小依次為秋季>夏季>春季>冬季；不同季節(jié)肌肉中鮮味氨基酸含量大小依次為秋季>春季>冬季>夏季；棘胸蛙肌肉中鮮味氨基酸總量與氨基酸總量的變化趨勢(shì)一致，氨基酸總量、必需氨基酸和鮮味氨基酸在不同季節(jié)中變化幅度不大，均在秋季棘胸蛙肌肉中含量最高。不同季節(jié)棘胸蛙肌肉中必需氨基酸含量與氨基酸總量的比值在0.41～0.42，根據(jù)FAO/WHO提出的必需氨基酸含量與氨基酸總量的比值在40%以上[15]，可以得出棘胸蛙氨基酸組成較為均衡，其中以秋季肌肉中占比最高，冬季最低。不同季節(jié)鮮味氨基酸含量與氨基酸總量比值在0.37～0.38，夏季肌肉中鮮味氨基酸總量低。

表2 氨基酸含量季節(jié)變化情況（干重g/100 g）Table 2 Seasonal variation of amino acids contents(dry weight g/100 g)

2.3 必需氨基酸組成評(píng)價(jià)

不同季節(jié)必需氨基酸含量如表3所示。不同季節(jié)棘胸蛙肌肉中必需氨基酸含量均為賴氨酸含量最高，蛋氨酸+胱氨酸含量最低。與FAO/WHO評(píng)分模式標(biāo)準(zhǔn)值相比，除夏季與秋季的蛋氨酸+胱氨酸含量低于FAO/WHO評(píng)分模式標(biāo)準(zhǔn)值，其余種類氨基酸含量均比標(biāo)準(zhǔn)值高。必需氨基酸指數(shù)在92.63%～97.49%，其中秋季氨基酸指數(shù)最高，冬季最低。不同季節(jié)棘胸蛙肌肉中氨基酸評(píng)分與化學(xué)評(píng)分如表4所示，其肌肉的AAS評(píng)分均在0.85以上，CS化學(xué)評(píng)分均在0.65以上，表明棘胸蛙肌肉營養(yǎng)價(jià)值較高。依據(jù)AAS評(píng)分和CS評(píng)分作為棘胸蛙的營養(yǎng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，棘胸蛙肌肉的第一限制性氨基酸與第二限制性氨基酸在不同季節(jié)時(shí)存在差異，春季和冬季第一限制性氨基酸為纈氨酸，第二限制性氨基酸為蛋氨酸+胱氨酸；夏季和秋季第一限制性氨基酸均為蛋氨酸+胱氨酸，第二限制性氨基酸為纈氨酸。

表3 不同季節(jié)必需氨基酸含量（mg/g·N）Table 3 Changes of essential amino acids content in different seasons (mg/g·N)

表4 不同季節(jié)氨基酸AAS評(píng)分和CS評(píng)分Table 4 AAS and CS in different seasons

2.4 不同季節(jié)棘胸蛙肌肉脂肪酸組成分析

不同季節(jié)棘胸蛙肌肉中脂肪酸組成存在差異，如表5所示。春季和夏季組成相同，共9種，其中飽和脂肪酸2種，單不飽和脂肪酸2種，多不飽和脂肪酸5種；秋季脂肪酸組成最豐富，共18種，其中飽和脂肪酸7種，單不飽和脂肪酸4種，多不飽和脂肪酸7種；冬季脂肪酸共15種，其中飽和脂肪酸5種，單不飽和脂肪酸3種，多不飽和脂肪酸7種。秋季棘胸蛙肌肉的脂肪酸組成中C18:1n9c（油酸，28.33%）含量最高，其他三季中均為C18:2n6c（亞油酸）含量最高。不同季節(jié)棘胸蛙肌肉中飽和脂肪酸含量大小依次為秋季>春季>夏季>冬季；多不飽和脂肪酸含量大小依次為夏季>春季>冬季>秋季；單不飽和脂肪酸含量大小依次為秋季>夏季>春季>冬季，飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸含量均為秋季最高，冬季最低；多不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比值為0.42～1.64，高于世界衛(wèi)生組織的建議值（0.4～0.5）。棘胸蛙肌肉脂肪酸中EPA+DHA的含量在不同季節(jié)的變化規(guī)律與多不飽和脂肪酸并不相同，其中夏季含量最高，在春季和夏季棘胸蛙肌肉中未檢測(cè)到C20:5n3c（EPA）。

表5 不同季節(jié)棘胸蛙肌肉脂肪酸組成（干重%）Table 5 Fatty acids composition in muscle of Quasipaa spinosa in different seasons (dry weight %)

3 討論

兩棲動(dòng)物作為變溫動(dòng)物，其體溫與環(huán)境溫度密切相關(guān)，為應(yīng)對(duì)冬季低溫和食物短缺，兩棲動(dòng)物會(huì)進(jìn)入冬眠狀態(tài)，冬眠狀態(tài)下代謝受到抑制，并且其機(jī)體代謝強(qiáng)度隨季節(jié)改變而變化。以往研究表明，冬眠期間兩棲動(dòng)物的基礎(chǔ)代謝降低，主要利用肝臟和肌肉等組織中的脂肪及糖原為其提供能量，這些器官的質(zhì)量在冬眠前明顯加重，在冬眠后出現(xiàn)萎縮現(xiàn)象，在冬季即將結(jié)束時(shí)，許多未成熟的兩棲類的脂肪幾乎被耗盡[16]。本文結(jié)果中棘胸蛙冬季時(shí)肌肉粗蛋白和粗脂肪含量最高，表明棘胸蛙在冬眠前會(huì)積蓄能量以應(yīng)對(duì)冬眠期間的能量消耗。棘胸蛙肌肉中粗蛋白含量高于棘腹蛙（Paa boulengeri）[17]；粗脂肪含量高于泰國虎紋蛙（Rana tigrina cantor）[18]，棘腹蛙[17]和中國林蛙（Rana chensinensis）[19]。

棘胸蛙肌肉中氨基酸的組成種類在不同季節(jié)均為谷氨酸含量最高，胱氨酸含量最低，與牛蛙（Lithobates catesbeiana）[20]和黑斑蛙（Pelophylax nigromaculatus）[21]中的氨基酸組成情況相似。棘胸蛙肌肉中氨基酸組成均衡，接近FAO/WHO提出的理想蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，其肌肉中必需氨基酸含量在不同季節(jié)均以賴氨酸含量最高，而賴氨酸是食物中最容易缺乏的氨基酸，具有促進(jìn)人體鈣吸收等作用[22]，表明了棘胸蛙可以作為一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來源。棘胸蛙肌肉中的第一限制性氨基酸與第二限制性氨基酸在不同季節(jié)存在差異，其限制性氨基酸類型與黑斑蛙的研究結(jié)果相同[23]，但與虎紋蛙不同[24]。不同季節(jié)中棘胸蛙肌肉中的氨基酸總量、必需氨基酸和鮮味氨基酸含量在秋季最高，冬季棘胸蛙肌肉中必需氨基酸總量最低。除此之外，棘胸蛙肌肉的氨基酸總量與粗蛋白含量的季節(jié)變化規(guī)律并非一致，造成上述結(jié)果差異的原因可能是冬季禁食狀態(tài)下能量代謝消耗與其他季節(jié)不同。在大量進(jìn)食的情況下，其能量主要用于滿足生長及性腺發(fā)育，而在冬眠禁食期間，棘胸蛙活動(dòng)量減弱，并且處于禁食狀態(tài)，其主要依靠體內(nèi)的糖原和脂類物質(zhì)作為能量維持生存，然后才動(dòng)用蛋白質(zhì)供能，有研究表明當(dāng)水生動(dòng)物遭受饑餓脅迫時(shí)，其自身能夠?qū)被徂D(zhuǎn)化為葡萄糖來提供能量，具體表現(xiàn)為必需氨基酸總量和氨基酸總量的下降[25]。低溫也會(huì)抑制其體內(nèi)氨基酸的合成。有研究表明高山倭蛙（Nanorana parkeri）肝臟和肌肉組織中必需氨基酸的含量在冬眠期顯著降低（P<0.05），其體內(nèi)參與氨基酸合成的基因在冬眠期顯著下調(diào)[26]。

棘胸蛙肌肉中脂肪酸組成在不同季節(jié)存在差異（P<0.05），其中秋季脂肪酸組成最為豐富，造成差異可能是由于不同季節(jié)棘胸蛙對(duì)于營養(yǎng)需求的不同造成的，另外，環(huán)境氣溫的變化也有可能影響肌肉中脂肪酸的組成。為抵御冬季低溫，兩棲動(dòng)物通常會(huì)提高其組織中的不飽和脂肪酸含量，或者增加膜磷脂中不飽和脂肪酸的比例，這種機(jī)制能導(dǎo)致生物膜在低溫環(huán)境下保持正常的流動(dòng)性[27]，并且高水平的不飽和脂肪酸可以有效提高冬眠期間的存活時(shí)間，從而提高兩棲動(dòng)物的冬季存活率[28]。已有研究表明，高山倭蛙肝臟和肌肉組織中不同種類的不飽和脂肪酸含量在結(jié)冰處理后顯著上升[26]。棘胸蛙的肌肉粗脂肪含量與脂肪酸含量的季節(jié)變化規(guī)律并不一致，可能原因是其對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的代謝利用在不同季節(jié)存在差異，肌肉中的粗脂肪除包含脂肪酸外，還包含有其他物質(zhì)，饑餓脅迫下大多數(shù)動(dòng)物主要消耗機(jī)體儲(chǔ)存的糖原和脂類物質(zhì)來維持其基礎(chǔ)代謝，并且由于不同組織器官中脂肪酸比例不同，因此在能量利用上也存在先后差異。例如，饑餓前期的太平洋鮭（Oncorhynchusspp.）主要消耗肝臟脂肪作為能量維持生命活動(dòng)，能耗較低；饑餓中后期主要以消耗腸系膜脂肪和肌肉脂肪作為能量維持生命活動(dòng)[29]。冬季肌肉中脂肪酸的總量下降主要是由SFA和MUFA的含量大幅下降所導(dǎo)致。有研究表明水生動(dòng)物在饑餓脅迫下主要利用體內(nèi)不同組織脂肪中的SFA和MUFA供能，從而節(jié)約機(jī)體蛋白質(zhì)與脂肪中的PUFA以維持重要的生命活動(dòng)[30]。與養(yǎng)殖黑斑蛙相比，黑斑蛙肌肉中脂肪酸組成為單不飽和脂肪酸>多不飽和脂肪酸>飽和脂肪酸[21]，這可能與所攝食的餌料不同相關(guān)，本研究中棘胸蛙主要投喂黃粉蟲，而養(yǎng)殖黑斑蛙飼養(yǎng)過程主要投喂人工配合飼料。棘胸蛙肌肉富含人體所必需的脂肪酸如亞油酸、亞麻酸，并且高于黑斑蛙[21]和中國林蛙[31]，其肌肉中的多不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比值為0.42～1.64，高于世界衛(wèi)生組織的建議值0.4～0.5[32]，說明棘胸蛙的肌肉脂肪酸品質(zhì)較高。

4 結(jié)論

棘胸蛙作為一種高檔水產(chǎn)品，其富含氨基酸和脂肪酸，且營養(yǎng)均衡，是較為優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來源。季節(jié)變化對(duì)于棘胸蛙肌肉中營養(yǎng)成分的影響顯著（P<0.05）。不同季節(jié)下棘胸蛙肌肉中粗脂肪和粗蛋白含量變化較大，均為冬季時(shí)含量最高；肌肉中氨基酸組成種類在不同季節(jié)相同，其中秋季棘胸蛙肌肉的總氨基酸含量（92.05±0.25）g/100 g、必需氨基酸含量（38.82±0.15）g/100 g和鮮味氨基酸含量（35.02±0.17）g/100 g均為最高；肌肉中脂肪酸組成種類在不同季節(jié)時(shí)不同，其中秋季棘胸蛙肌肉脂肪酸組成最為豐富，含有18種，其中飽和脂肪酸7種，單不飽和脂肪酸4種，多不飽和脂肪酸7種。秋季棘胸蛙肌肉中氨基酸和脂肪酸在含量和組成種類等方面均高于其余三個(gè)季節(jié)，因此，在后續(xù)針對(duì)棘胸蛙產(chǎn)品綜合開發(fā)時(shí)可以優(yōu)先考慮以秋季棘胸蛙肌肉為主。