HPLC-MS/MS 法測定化妝品中克霉唑含量的不確定度評定

蔣鳳兵

目前, 各式各樣功能各異的化妝品業(yè)已成為人們生活中必不可少的消費(fèi)品。 隨著行業(yè)需求和消費(fèi)的日益激增, 化妝品使用的安全問題也越來越突出[1]。 不少不法廠商在化妝品中超量添加限用物質(zhì)或者非法添加某些有害禁用物質(zhì), 以期達(dá)到某種功能上的特效, 吸引更多消費(fèi)者, 獲取更多的不法收益。 例如: 向化妝品中添加糖皮質(zhì)激素、 抗生素、 重金屬等等[2-3]。這不僅侵害了消費(fèi)者合法權(quán)益, 也嚴(yán)重危害到化妝品的行業(yè)發(fā)展。 化妝品中非法添加物質(zhì)的檢測工作一直在化妝品安全監(jiān)管中發(fā)揮著重要的作用。

由于儀器設(shè)備、 環(huán)境變化以及人員操作等因素的影響, 會給化妝品的定量檢驗工作引入一定的不確定度[4-9]。 科學(xué)的、完整的對實驗過程中的各環(huán)節(jié)各影響因素進(jìn)行不確定度評定,將增加檢驗數(shù)據(jù)的完整性、 科學(xué)性與可比性。 本文按照《測量不確定度評定與表示》JJF 1059.1-2012[10]和《常用玻璃量器檢定規(guī)程》JJG 196-2006[11]的要求, 評定了《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015 年版)[12]中高效液相質(zhì)譜法檢驗化妝品克霉唑含量的不確定度。 為實驗室做精做細(xì)檢驗檢測及質(zhì)量控制提供依據(jù),同時為檢測化妝品中其他抗感染類藥物含量的不確定度評定提供參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器和材料

1.1.1 儀 器

Thermo Fisher Scientific Vanquish 超高效液相色譜儀;Thermo Fisher Scientific TSQ Endura 三重四級桿質(zhì)譜儀; 渦旋震蕩器, 江蘇康健; AllegraX-30R 冷凍離心機(jī), 貝克曼; XPE204萬分之一天平, 梅特勒-托利多; MSA225S-1CE-D1 十萬分之一天平, 賽多利斯; KQ-800KDE 超聲提取儀, 昆山市超聲儀器有限公司。

1.1.2 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)品: 克霉唑(Clotrimazole, 中國食品藥品檢定研究院,批號: 100037-202008, 含量: 99.5%); 試劑: 乙腈和甲酸(Thermo Fisher Scientific, 分析純); 樣品: 日常監(jiān)督陽性樣品。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 色譜條件

色譜柱: Thermo Hypersil Gold C18(100 mm×2.1 mm 1.9 μm),柱溫: 40 ℃; 流動相: 含0.1%甲酸乙腈(A), 含0.1%甲酸水(B)。 梯度洗脫(0.0 ～2.0 min, 20%A; 2.0 ～4.0 min, 20%A→90%A; 4.0 ～6.0 min, 90%A; 6.0 ～6.2 min, 90%A→20%A; 6.2 ～8.0 min, 20%A)。 流速為0.3 mL/min, 進(jìn)樣量為2.0 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧源(ESI), 噴霧電壓為3500 V, 鞘氣流速為35 Arb, 輔助氣流速為10 Arb, 尾吹氣流速為1 Arb, 離子傳輸管溫度為350 ℃, 霧化器溫度為350 ℃。 采用正離子模式,多級反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。 質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters

1.3 溶液的配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取克霉唑標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg, 至50 mL 容量瓶中, 加甲醇適量, 超聲溶解, 放涼, 加甲醇并定容至刻度, 作為標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。 準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)品儲備液1.0 mL, 至100 mL 容量瓶中, 加甲醇稀釋并定容至刻度, 搖勻, 作為標(biāo)準(zhǔn)品工作儲備溶液。 準(zhǔn)確吸量取標(biāo)準(zhǔn)品工作儲備溶液0.1、 0.2、 0.4、 0.5、1.0 mL, 至10 mL 容量瓶中, 加入甲醇稀釋并定容至刻度, 得S1、 S2、 S3、 S4、 S5 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.3.2 樣品溶液的配制

稱取樣品約0.2 g, 置于10 mL 容量瓶中, 加入飽和氯化鈉溶液1 mL, 在渦旋震蕩器上渦旋30 s。 加入5 mL 乙腈, 渦旋30 s, 超聲提取30 min。 靜置至室溫, 用乙腈定容至刻度, 搖勻, 以4500 r/min 離心10 min, 取上清液0.22 μm 濾膜過濾,濾液作為樣品溶液。

2 測定模型

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和樣品溶液分別注入高效液相串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀法測定。 以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中克霉唑的含量為橫坐標(biāo), 以峰面積為縱坐標(biāo), 擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線, 并計算樣品溶液中克霉唑的質(zhì)量濃度。 并按照式(1)計算化妝品中克霉唑的含量:

式中:ω為化妝品中克霉唑的質(zhì)量分?jǐn)?shù), μg/g;ρ為樣品溶液中克霉唑的質(zhì)量濃度, μg/mL;V為樣品定容體積, mL;m為樣品取樣量, g。

3 測量不確定度來源

綜合分析實驗過程, 測量結(jié)果的不確定度主要來自以下幾個方面: (1)標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度urel(1); (2)樣品引入的不確定度urel(2); (3)儀器引入的不確定度urel(3); (4)測量重復(fù)性引入的不確定度urel(4)。 化妝品中克霉唑測量的不確定度按式(2)合成。

4 不確定度評定及合成

4.1 標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度

4.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度

證書上查得克霉唑標(biāo)準(zhǔn)品純度為99.5%, 服從矩形分布,包含因子由標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度則為相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度則為ur,1(P)=

4.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的不確定度

由天平計量證書可知, 該天平的偏載誤差為±0.03 mg。偏載誤差不確定度服從矩形分步, 包含因子由標(biāo)準(zhǔn)品的稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度克霉唑標(biāo)準(zhǔn)品稱量約10 mg, 則標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

4.1.3 標(biāo)準(zhǔn)品儲備液定容引入的不確定度

(1)定容體積引入的不確定度

克霉唑標(biāo)準(zhǔn)品稱取置50 mL 容量瓶中溶解定容。 JJG 196-2006 中規(guī)定, 在20 ℃時50 mL 的A 級容量瓶的容量誤差為±0.05 mL, 不確定度服從三角分布,則由標(biāo)準(zhǔn)品儲備液定容體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

(2)溫度引入的確定度

在20 ℃時, 玻璃儀器和甲醇體積膨脹系數(shù)a1、 a2分別為2.5×10-5、 1.19×10-3。 實驗在23 ℃條件下進(jìn)行, 由溫度引起的體積變化ΔV=(a2-a1)×50×ΔT=0.17475 mL, 體積不確定度服從三角分布,則使用50 mL A 級容量瓶時, 溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

則標(biāo)準(zhǔn)儲備液定容引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur,1(V)=

4.1.4 儲備液稀釋過程引入的不確定度

精密量取標(biāo)準(zhǔn)品儲備液1.0 mL, 至100 mL 量瓶中, 用甲醇溶解并定容至刻度, 搖勻, 作為標(biāo)準(zhǔn)品工作儲備溶液。 按照矩形分布處理, 玻璃器皿及溫度波動引入的不確定度見表2。

表2 儲備液稀釋過程引入的不確定度Table 2 Uncertainties arising from stock solution dilution

則儲備液稀釋過程引入的不確定度為:

4.1.5 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的稀釋引入的不確定度

(1)移液體積引入的不確定度

系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的稀釋過程中使用了200 μL 和1000 μL移液器。 由移液器校準(zhǔn)證書可知, 200 μL 和1000 μL 移液器的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為0.25 和0.20。 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各濃度點(diǎn)溶液移液體積引入不確定度見表3。 則移液體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

表3 系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中移液體積引入不確定度Table 3 Uncertainty introduced by pipetting volume during preparation of series standard solutions

(2)溫差引入的不確定度

按4.1.3(3)項下同法評定, 由使用溫度和校準(zhǔn)溫度不同引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur,1(d2)=0.001427。 則合成系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的稀釋引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ur,1(d) =

4.1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度

不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液, 分別測定2 次, 得到相應(yīng)的響應(yīng)值, 最小二乘法進(jìn)行擬合, 得到直線方程和相關(guān)系數(shù)為y=13003X+28125, r=0.9993, 具體數(shù)據(jù)情況見表4。

表4 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液測定值和計算結(jié)果Table 4 Measured values and calculation results of standard series solutions

根據(jù)貝塞爾公式計算標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)差:

對同一樣品溶液進(jìn)行了4 次測定, 平均濃度為93.2059 ng/mL。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合帶來的不確定度計算公式進(jìn)行計算, 本次實驗的標(biāo)準(zhǔn)曲線不確定度為:

式中, n 為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的測量點(diǎn)數(shù), n=10; p 為待測樣品的重復(fù)測定數(shù), p=4;為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的平均濃度值,c=108.9246 ng/mL, x 為測試樣品的濃度平均值, x=93.2059 ng/mL; Ci為標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)的濃度值; b 為擬合曲線的斜率。

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合帶來的相對不確定度為:

則由標(biāo)準(zhǔn)品引入的相對不確定度為:

4.2 樣品引入的不確定度

4.2.1 由樣品稱樣引入的不確定度

取樣本次實驗稱量準(zhǔn)確至0.0001 g, 使用天平為計量檢定合格, 該準(zhǔn)確級別天平的最大允差為±0.0005 g, 按天平引起的不確定度呈均勻分布, 則稱樣量為0.2 g, 則天平引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

4.2.2 由樣品溶液定容引入的不確定度

(1)容量允差引入的不確定度

20 ℃, 10 mL A 級容量瓶的容量允差為±0.020 mL, 取均勻分布, 則試液定容時引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:則其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

(2)溫度引入的不確定度

玻璃儀器和乙腈在20 ℃時體積膨脹系數(shù)a1、 a2分別為2.5×10-5、 1.37×10-3。 實驗溫度為23 ℃時, 使用10 mL A 級容量瓶, 由溫度差引起的體積變化ΔV=(a2-a1)×10×ΔT=0.04035 mL,體積不確定度服從三角分布,則使用10 mL A 級容量瓶時, 溫度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度則由樣品溶液定容引入的不確定度為:

綜上, 樣品引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(2) =

4.3 儀器引入的不確定度

查儀器校準(zhǔn)證書可知高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀重復(fù)性相對相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2%,k=2, 其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度0.01。

4.4 測量重復(fù)性引入的不確定度

本次實驗在重復(fù)性條件下對每個樣品中克霉唑進(jìn)行了6 次測定, 結(jié)果分別為9.1416 μg/g、 9.3594 μg/g、 9.1492 μg/g、9.2377 μg/g、 9.4070 μg/g、 9.3707 μg/g。

單次測量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

算術(shù)平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

因此, 克霉唑含量的算術(shù)平均值的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

將上述各環(huán)節(jié)引入不確定度代入式(1), 計算得出本次實驗克霉唑的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

5 擴(kuò)展不確定度及結(jié)果表示

實驗所得樣品中克霉唑含量平均為9.2562 μg/g, 其標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(ω)=urel(ω)×ω=0.2314 μg/g, 依據(jù)JJF 1059.1-2012,取k=2(p=95%), 擴(kuò)展不確定度U=k×u(ω)=0.4628 μg/g。 則樣品中克霉唑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)ω=9.2562±0.4628 μg/g,k=2。