MMI-0100對大鼠良性前列腺增生的抑制作用及其機制*

陳濤，汪娟，黃文濤

(武漢市第一醫院藥學部，武漢 430022)

良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)是一種慢性和非惡性泌尿生殖系統疾病，中老年男性高發[1]。報道顯示，BPH的發病率從40歲男性群體中的8%大幅上升至90歲男性群體中的90%[2]。BPH作為一種良性的腺體增生雖然在短期內并不會直接危害患者的生命安全，但BPH是患者產生尿頻和尿潴留等下尿路綜合征(lower urinary tract symptoms，LUTS)的關鍵原因，嚴重影響患者的生活質量[3]。5α-還原酶抑制藥和α-受體阻斷藥是BPH臨床治療的雙子星藥物[4]。然而，盡管5α-還原酶抑制藥和α-受體阻斷藥的廣泛應用，BPH-LUTS的風險仍然存在。約20%有癥狀的BPH患者不得不接受手術[5]。與此同時，植物制劑也在BPH的防治中占據一定份額。但植物制劑的具體作用機制并不明確[4]。繼續尋找BPH的防治靶點仍是業內關注的重點。筆者[6]前期研究發現改善前列腺膠原沉積和纖維化是防治BPH的可行方向。MMI-0100是一種細胞滲透肽，對心肌纖維化等具有一定改善作用[7]。然而有關MMI-0100在BPH和前列腺纖維化中的作用鮮有報道。本文探討MMI-0100對BPH大鼠的防治作用和可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 丙酸睪酮注射液購于天津金耀藥業有限公司(規格為1 mL：25 mg；批號：150822)。MMI-0100購于南京金斯瑞生物科技有限公司(序列：YARAAARQARAKALARQLGVAA；批號：C1392DK230-1/PE4329)。抗體P38(批號：ab32142)和磷酸化P38(phosphorylation-P38，p-P38)-P38(批號：ab38238)購于英國Abcam公司，波形蛋白(vimentin，VIM)(批號：10366-1-AP)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)(批號：55135-1-AP)、轉化生長因子-β1(TGF-β1)(批號：21898-1-AP)和絲裂原活化蛋白激酶活化蛋白激酶2(mitogen activated protein kinase activated protein kinase 2、MK2)(批號：13949-1-AP)購于美國Proteintech公司，p-MK2購于美國Santa cruz公司(批號：sc-293139)。MK3型酶標儀(芬蘭雷勃公司)，Ulupure型超純水機(法國 Millipore公司)，Tanon-5200型全自動化學發光分析儀(上海天能科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組與造模 雄性Wistar大鼠購于遼寧長生生物技術股份有限公司，7周齡，體質量160～180 g。實驗動物適應環境1周后，隨機分為3組(n=6)：正常對照組、模型對照組和MMI-0100組。大鼠BPH模型參考文獻[3]，通過手術去勢(切除睪丸)后每日皮下注射 5 mg·kg-1·d-1丙酸睪酮，連續30 d。MMI-0100組每日腹腔注射40 μg·kg-1MMI-0100。給藥劑量參考文獻[7]并根據動物體表面積換算得出。正常對照組大鼠切開下腹部后隨即縫合(假手術)。30 d實驗周期后，記錄大鼠體質量。大鼠腹腔注射100 mg·kg-1戊巴比妥鈉麻醉，處死。實驗操作遵從《湖北省實驗動物管理條例》。處死大鼠后分離前列腺，記錄前列腺質量。前列腺指數=前列腺質量(g)/體質量(100 g)。隨后分割前列腺組織，部分組織在4 ℃浸泡于4%多聚甲醛用于石蠟包埋和組織切片。部分新鮮組織剪碎后液氮研磨用于提取總蛋白和總RNA。

1.2.2膠原沉積和上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)評價 通過蘇木精-伊紅(HE)染色前列腺組織切片觀察前列腺增生情況。每張切片隨機選取視野3個，每個視野隨機選取3處測量前列腺上皮厚度。通過馬松(Masson)染色觀察前列腺膠原沉積。通過免疫組化染色前列腺組織切片、Western blotting(WB)和實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)檢測前列腺新鮮組織VIM和α-SMA的表達和 mRNA水平來評價前列腺EMT。VIM(NM_003380.5)前引物為5′-TGCCAACCGGAACAACGAT-3′，后引物為5′-AATTCTCTTCCATTTCACGCATC-3′和α-SMA(NM_031004.2)前引物為5′-CGGGCATCCACGAAACCA-3′，后引物為5′-GAGCCGCCGATCCAGACA-3′。GAPDH(NM_017008.4)為內參，前引物為5′-CAAGTTCAAC-GGCACAG-3′，后引物為5′-CCAGTAGACTCCACGACAT-3′。根據RT-qPCR Master Mix說明書操作于real-time PCR system(ABI StepOne Plus)進行qPCR檢測。

1.2.3P38/ MK2/TGF-β1信號通路評估 通過Western blotting測定MK2、p-MK2、P38、p-P38和TGF-β1的蛋白表達水平評估前列腺P38/ MK2/TGF-β1信號通路的活躍程度。提取前列腺新鮮組織總蛋白后，采用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉膜。于室溫環境下，用5%脫脂奶粉封閉2 h，隨后用相應的一抗在4 ℃環境下孵育12 h。洗滌后，用辣根過氧化物酶標記二抗于室溫環境下孵育1 h。電化學發光并采用全自動化學發光分析儀檢測，通過TANONGIS軟件記錄灰度值。

2 結果

2.1MMI-0100抑制前列腺增生和膠原沉積 正常對照組、模型對照組和MMI-0100組大鼠前列腺指數分別為(2.72±0.15 )×10-2，(3.51±0.14 )×10-2，(3.12±0.10)×10-2。與正常對照組比較，模型對照組大鼠前列腺指數顯著升高(t=-10.129，P<0.05)。與模型對照組比較，MMI-0100組前列腺指數顯著降低(t=6.026，P<0.05)。 正常對照組、模型對照組和MMI-0100組大鼠前列腺上皮厚度分別為(21.7±1.56)，(40.26±4.52)，(26.32±3.27) μm。與正常對照組比較，模型對照組前列腺上皮厚度顯著增加(t=-10.973，P<0.05)。與模型對照組比較，MMI-0100組前列腺上皮厚度顯著減小(t=7.062，P<0.05)。Masson染色顯示，MMI-0100能夠抑制BPH大鼠的前列腺膠原沉積。見圖1。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.MMI-0100組。圖1 3組大鼠前列腺組織HE和Masson染色(×200) A.normal control group；B.model control group；C.MMI-0100 group.Fig.1 HE and Masson staining of prostate tissue in three groups of rats(×200)

2.2MMI-0100抑制前列腺EMT 從圖2定性分析可見，與正常對照組比較，模型對照組大鼠前列腺VIM和α-SMA的表達增強。MMI-0100能有效抑制前列腺VIM和α-SMA的表達。見圖3，與正常對照組比較，模型對照組大鼠前列腺VIM和α-SMA的mRNA水平以及蛋白表達均顯著升高(P<0.05)。與BPH模型對照組比較，MMI-0100組VIM和α-SMA的mRNA水平以及蛋白表達水平均顯著降低(均P<0.05)。說明MMI-0100能夠抑制BPH大鼠前列腺的EMT。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.MMI-0100組。圖2 3組大鼠前列腺組織α-SMA和VIM表達(×200) A.normal control group；B.model control group；C.MMI-0100 group.Fig.2 Expression of α-SMA and VIM in prostate tissues of three groups of rats(×200)

A.正常對照組；B.模型對照組；C.MMI-0100組。①與正常對照組比較，t=-9.172～-3.521，P<0.05；②與模型對照組比較，t=-7.833～-3.454，P<0.05。圖3 3組大鼠前列腺組織α-SMA和VIM的mRNA及蛋白表達水平±s，n=6) A.normal control group；B.model control group；C.MMI-0100 group.①Compared with normal control group，t=-9.172—-3.521，P<0.05；②Compared with model control group，t=-7.833—-3.454，P<0.05.Fig.3 α-SMA and VIM mRNA and protein levels in prostate tissues of three groups of ±s，n=6)

2.3MMI-0100抑制前列腺P38/ MK2/TGF-β1信號通路 由圖4可見，與正常對照組比較，模型對照組大鼠前列腺P38和MK2的磷酸化水平以及TGF-β1的表達均顯著升高(均P<0.05)。MMI-0100組MK2的磷酸化水平及TGF-β1的表達均顯著降低(均P<0.05)。同時，MMI-0100組大鼠前列腺P38的磷酸化水平并未明顯改變(P>0.05)。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.MMI-0100組。①與正常對照組比較，t=-9.456～3.515，P<0.05；②與模型對照組比較，t=-0.792，-7.563，-3.223，P<0.05。圖4 3組大鼠前列腺組織p-P38、P38、p-MK2、MK2和TGF-β1表達水平 A.normal control group；B.model control group；C.MMI-0100 group.①Compared with normal control group，t=-9.456-3.515，P<0.05；②Compared with model control group，t=-0.792，-7.563，-3.223，P<0.05.Fig.4 Expression levels of p-P38，P38，p-MK2，MK2 and TGF-β1 in prostate tissues of three groups of rats

3 討論

BPH-LUTS的病因學復雜，其確切的病理機制至今尚未完全闡明。器官纖維化是結締組織的結構重建過程，包括成肌細胞活化、膠原沉積和細胞外基質(extracellular matrix，ECM)重塑等[8]。器官纖維化是衰老、組織損傷和器官功能紊亂的病理基礎之一[9]。研究發現，前列腺纖維化造成尿道周圍組織硬度增加是BPH導致LUTS的重要原因[8，10]。ECM是一類由支持細胞分泌的細胞外分子的總稱，其成分和比例對維持細胞外環境穩定和正常生理功能至關重要[11]。其中，α-SMA的過量產生是肌成纖維細胞分化的標志之一[10]。EMT是細胞由上皮表型轉化為間質表型的過程，將破壞上皮屏障中的細胞-細胞粘附[12]。該過程中間質標記物VIM和α-SMA表達明顯上升。其中，VIM在調節細胞骨架和細胞粘附方面發揮關鍵作用[13]。細胞失去極性、喪失細胞間的粘附能力并引起細胞骨架成分改變，新形成的間質細胞沿基底ECM侵入下層組織，是器官纖維化的核心基礎之一[14]。本研究結果顯示MMI-0100能夠抑制BPH模型大鼠的前列腺膠原沉積，并改善前列腺EMT，說明MMI-0100具有防治BPH和前列腺纖維化的潛力。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)家族參與細胞增殖、分化和凋亡等多種生物過程[15]。報道顯示MAPKs家族中的經典通路均參與BPH[11]。其中，P38是MAPKs家族重要的一員。其磷酸化激活具有促進成纖維細胞分化和膠原沉積的作用[7]。MK2是一種細胞內絲氨酸/蘇氨酸激酶，也是MAPK的活化蛋白激酶。MK2是P38的下游，其磷酸化水平與P38的磷酸化水平成正比[15]。不僅如此，經P38活化后，磷酸化的MK2將作用于P38信號鏈的遠端下游靶點TGF-β[16]。TGF-β作為器官纖維化病變的關鍵因素之一，能夠明顯促進間質細胞增殖、成纖維細胞活化和ECM蛋白產生，從而誘導膠原沉積[10，17]。MK2是TGF-β誘導的α-SMA表達和肌成纖維細胞分化的必需節點[16]。TGF-β家族包括多種分型，其中TGF-β1與纖維化過程密切相關。抑制TGF-β1表達，從而阻斷經典的TGF-β1/Smad(drosophila mothers against decapentaplegic protein)信號通路和非Smad依賴的TGF-β1信號通路是抗纖維化治療的方向之一[18]。通過BPH患者前列腺組織的染色分析發現，5α-還原酶抑制藥和α-受體阻斷藥治療失敗的可能原因之一便是導致前列腺TGF-β的表達上升[10]。

細胞滲透肽MMI-0100是MK2的抑制劑，對心臟纖維化、肺纖維化等具有明顯的改善作用[7]。本研究進一步發現MMI-0100能夠減輕前列腺纖維化，其作用機制與抑制前列腺MK2的磷酸化表達從而阻斷P38/ MK2/TGF-β1信號通路有關，為BPH-LUTS的防治提供了可供參考的思路。在今后的研究中，筆者將深入探討MMI-0100干預對5α-還原酶抑制藥和α-受體阻斷藥耐受型BPH的治療潛力。