山楂葉總黃酮對高脂血癥腎損傷大鼠的保護作用*

周其其，閔潔，刁婷婷，3，張雨晨，肖峰，要輝，白育庭

(1.湖北科技學院藥學院，咸寧 437100；2.湖北省黃石市陽新縣人民醫(yī)院護理部，黃石 435200；3.信陽農(nóng)林學院生物與制藥工程學院，信陽 464000)

近年來，隨著社會的發(fā)展和生活水平的提高，人們飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，長期的高脂飲食會誘發(fā)心腦血管、內(nèi)分泌、生殖系統(tǒng)病變等多種疾病。其中，高脂血癥是脂質(zhì)代謝紊亂最典型的表現(xiàn)，由高脂血癥及其誘發(fā)的其他疾病造成患者死亡人數(shù)約占世界疾病死亡人數(shù)的一半[1]。高脂血癥可誘導單核巨噬細胞在腎臟堆積并抑制細胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)合成，從而誘發(fā)慢性腎損傷，導致腎功能受損[2]，因此，由高脂血癥所誘導的腎臟損傷也逐漸受到關注。

山楂葉為薔薇科植物山里紅的干燥葉，其主要成分為山楂葉總黃酮(hawthorn leaves flavonoids，HLF)，包括槲皮素、金絲桃苷、黃酮苷、葒草素、葡荊牡黃酮等多種黃酮類化合物[3]。研究表明，HLF在心腦缺血-再灌注損傷、肝損傷、腎臟損傷等方面均有保護作用，且能降低膽固醇從而調(diào)節(jié)血脂，而對于高脂血癥所引起的腎臟損傷的研究報道較少。故本實驗通過建立高脂模型[4]，探討HLF是否對高脂血癥大鼠腎臟具有保護作用及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 清潔級SD大鼠48只，雄性，體質(zhì)量170～200 g，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(遼)2015-0001；動物使用許可證號：SYXK(鄂)2018-0071]；分籠飼養(yǎng)，晝夜節(jié)律12 h，自由飲水攝食，大鼠實驗前適應性飼養(yǎng)7 d，室溫(22±2) ℃，相對濕度55%～60%。

1.1.2藥品與試劑 HLF購自山東臨沂愛康藥業(yè)有限公司(批號：AKH16-3，含量93.5%)。高脂飼料購于北京茆思倍科生物科技有限公司。三酰甘油(TG，批號：20180731)、總膽固醇(TC，批號：20180731)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C，批號：20180816)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C，批號：20180817)、超氧化物歧化酶(SOD，批號：A001-1)、丙二醛(MDA，批號：A003-1)、還原型谷胱甘肽(L-glutathione，GSH，批號：A006-1-1)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px，批號：A005-1)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。兔鏈霉素卵白素-生物素法檢測(兔SP，批號：SP-9001)試劑盒購自中山金橋公司，白細胞介素(IL)-1β(批號：EK301/3-01)、IL-6(批號：EK306/3-01)以及腫瘤壞死因子α(TNF-α，批號：EK382/3-01)購于生物聯(lián)科公司。二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色液(批號：DA1010)和曲拉通Triton X-100(批號：T8200)購于索萊寶科技有限公司。單核細胞趨化蛋白(monocyte chemoattractant protein，MCP)-1抗體(bs-1101R)和TGF-β1(bs-0086R)抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。核因子(nuclear factor，NF)-κB P65(#8242)購于Cell Signaling Technology。

1.1.3儀器與設備 電子分析天平(德國Sartorius公司，感量：0.1 mg)；多功能酶標儀(瑞士 Tecan Spark公司)；電腦生物組織脫水機(YAGANG公司)；石蠟包埋機(YAGANG公司)；石蠟切片機(美國Thermo公司)；化學發(fā)光成像系統(tǒng)(美國伯樂 Chemi-Doc公司)； 低溫高速離心機TGL-20M(湖南湘儀離心機儀器有限公司)；KZ-II 高速組織研磨儀(武漢塞維爾生物科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組與造模 SD大鼠 48只，采用隨機數(shù)字表法平均分為6組，分別為正常對照組，模型對照組，辛伐他汀組，HLF小、中、大劑量組，每組8只，適應性喂養(yǎng)7 d后，正常對照組和模型對照組灌胃0.9%氯化鈉溶液1 mL·(100 g)-1·d-1，辛伐他汀組灌胃辛伐他汀8 mg·kg-1·d-1，HLF小、中、大劑量組分別灌胃HLF 100，200，400 mg·kg-1·d-1，連續(xù)灌胃給藥8周。正常對照組每日飼喂大鼠維持普通飼料，另5組飼喂高脂飲食，飲水攝食自由。大鼠最后一次給藥禁食12 h后處死進行取材。

1.2.2生化指標的測定 采用酶標儀測定血漿中的TG、TC、HDL-C和LDL-C等脂質(zhì)指標的吸光度(A)值[5]。同時，采用同樣的方法測定血漿中的SOD、MDA、GSH和GSH-Px等氧化指標的濃度。

1.2.3炎性指標的測定 采用酶聯(lián)免疫吸附測定實驗(ELISA)法測定血漿中的IL-1β、IL-6以及TNF-α的含量，根據(jù)標準曲線計算濃度。

1.2.4蘇木精-伊紅( HE)染色法觀察大鼠腎臟組織的形態(tài) 大鼠腎臟組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，經(jīng)沖洗約1 h以去除表面甲醛后，電腦生物組織脫水機脫水，依次透明、浸蠟，包埋、切片、脫蠟和染色，利用顯微鏡觀察每組大鼠腎組織的病理形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.2.5馬松(Masson)染色法觀察大鼠腎臟組織的形態(tài) 組織切片脫蠟水化與HE法相同，染色采用試劑盒說明書進行操作，光鏡下觀察6組大鼠腎組織的纖維化程度。

1.2.6免疫組織化學法檢測腎臟組織中MCP-1和TGF-β1蛋白的表達情況 取各組腎臟組織石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，進行抗原修復15 min，自然狀態(tài)冷卻，加入0.1%Triton X-100室溫孵育約40 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)快速洗3次(每次10 min)，封閉工作液封閉1 h，孵育一抗(1：200)過夜。PBS快速清洗3次，室溫孵育二抗1 h，PBS快速清洗3次，加入DAB染色8～10 min后用自來水沖洗數(shù)秒終止染色，蘇木精復染2 min，鹽酸乙醇分化6 s后按照HE法進行封片。光鏡下觀察各組的各種蛋白表達情況，利用Image profession Plus 6.0版軟件進行分析，采用平均A值定量表示MCP-1和TGF-β1的表達量。

1.2.7Western blotting法檢測大鼠腎臟組織中NF-κB P65、MCP-1以及TGF-β1蛋白的表達 稱取腎臟組織約50 mg，10倍體積的裂解液(RIPA：PMSF：cocktail：礬化鈉=100：1：1：1)迅速加入，低溫下研磨組織離心后取上清液，采用二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid，BCA)法測定各組蛋白濃度，調(diào)整蛋白體積后加入蛋白上樣緩沖液，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后一抗(1：1000)孵育14 h，與二抗反應后顯影，利用Image Lab軟件進行灰度值統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1HLF對高脂血癥大鼠血漿TG、TC、HDL-C、LDL-C的影響 經(jīng)前期課題組研究得出，與正常對照組比較，模型對照組TG、TC以及LDL-C明顯上升(P<0.01)，說明高脂血癥模型已建立成功。與模型對照組比較，辛伐他汀組與HLF給藥組TG、TC以及LDL-C明顯降低(P<0.05)，且與劑量呈正相關[5]。

2.2HLF對高脂血癥大鼠血漿中IL-1β、IL-6以及TNF-α的影響 與正常對照組比較，模型對照組IL-1β、IL-6以及TNF-α含量明顯增加(P<0.05)；與模型對照組比較，辛伐他汀組中IL-1β與TNF-α含量明顯降低(P<0.05)；HLF給藥組IL-1β、IL-6以及TNF-α均明顯降低(均P<0.05)，且與劑量相關，結(jié)果見表1。

表1 6組大鼠血漿中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量比較Tab.1 Comparison of plasma levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α among six groups of rats pg·mL-1，±s，n=6

2.3HLF 對高脂血癥大鼠血漿中SOD、MDA、GSH以及GSH-Px的影響 與正常對照組比較，模型對照組SOD明顯降低(P<0.05)，MDA明顯增加(P<0.05)，GSH活力與GSH-Px活力明顯降低(P<0.05)；與模型對照組比較，辛伐他汀組SOD的含量明顯增加(P<0.05)，MDA的含量明顯降低(P<0.05)，GSH-Px活力明顯增加(P<0.05)；HLF大劑量組SOD明顯增加(P<0.05)，MDA明顯降低(P<0.05)，GSH與GSH-Px活力明顯增加(P<0.05)，結(jié)果見表2。

表2 6組大鼠血漿中SOD、MDA、GSH及GSH-Px的含量比較 Tab.2 Comparison of plasma contents of SOD，MDA，GSH and GSH-Px among six groups of rats ±s，n=8

2.4HLF對高脂血癥大鼠腎臟組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 正常對照組腎臟組織的腎小球完整，無明顯損傷；模型對照組大鼠腎臟組織中腎小球結(jié)構(gòu)紊亂，體積增大，單核細胞浸潤明顯，系膜區(qū)增寬，基質(zhì)增厚，腎小球毛細血管出現(xiàn)分葉狀。與模型對照組比較，辛伐他汀組與HLF給藥組腎小球結(jié)構(gòu)有所改善，結(jié)果見圖1。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.辛伐他汀組；D.HLF小劑量組(100 mg·kg-1)；E.HLF中劑量組(200 mg·kg-1)；F.HLF大劑量組(400 mg·kg-1)。圖1 6組大鼠腎臟組織的形態(tài)結(jié)構(gòu) (HE，×400) A.normal control group；B.model control group；C.simvastatin group；D.HLF low dose group (100 mg·kg-1)；E.HLF medium dose group (200 mg·kg-1)；F.HLF high dose group (400 mg·kg-1).Fig.1 Morphological structure of kidney tissues in six groups of rats(HE，×400)

2.5HLF對高脂血癥大鼠腎臟組織的纖維化的影響 與正常對照組比較，模型對照組腎小球內(nèi)及腎間質(zhì)有較多的膠原纖維沉積，辛伐他汀組與HLF中、大劑量組纖維化程度明顯降低，HLF小劑量組纖維化降低程度不明顯，結(jié)果見圖2。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.辛伐他汀組；D.HLF小劑量組(100 mg·kg-1)；E.HLF中劑量組(200 mg·kg-1)；F.HLF大劑量組(400 mg·kg-1)。圖2 6組大鼠腎臟組織的纖維化程度(Masson，×400) A.normal control group；B.model control group；C.simvastatin group；D.HLF low dose group (100 mg·kg-1)；E.HLF medium dose group (200 mg·kg-1)；F.HLF high dose group (400 mg·kg-1).Fig.2 Fibrosis degree of kidney tissues in six groups of rats (Masson，×400)

2.6HLF對高脂血癥大鼠腎臟組織中MCP-1和TGF-β1蛋白表達的影響(免疫組織化學檢測) 結(jié)果表明，MCP-1與TGF-β1在腎小管和集合管中呈現(xiàn)較多，腎小球中較少。模型對照組與正常對照組比較，棕色明顯加深，辛伐他汀組與HLF小劑量組顏色較模型對照組顏色稍淺，HLF中、大劑量組顏色明顯減弱，且采用Image Pro Plus 6.0版軟件定量分析后得出與觀察的結(jié)果相符合，結(jié)果見圖3～5。

A．正常對照組; B．模型對照組; C．辛伐他汀組; D．HLF 小劑量組( 100 mg·kg-1);E．HLF 中劑量組( 200 mg·kg-1) ; F．HLF 大劑量組( 400 mg·kg-1) 。圖3 6組大鼠腎臟組織中MCP-1 蛋白的表達(×400)A．normal control group; B．model control group; C．simvastatin group; D．HLF low dose group ( 100 mg·kg-1) ; E．HLF medium dose group(200 mg·kg-1) ; F．HLF high dose group ( 400 mg·kg-1) ．Fig．3 Expression of MCP-1 protein in kidney tissues of six groups of rats(×400)

A.正常對照組；B.模型對照組；C.辛伐他汀組；D.HLF小劑量組(100 mg·kg-1)；E.HLF中劑量組(200 mg·kg-1)；F.HLF大劑量組(400 mg·kg-1)。圖4 6組大鼠腎臟組織中TGF-β1蛋白的表達(×400) A.normal control group；B.model control group；C.simvastatin group；D.HLF low dose group (100 mg·kg-1)；E.HLF medium dose group (200 mg·kg-1)；F.HLF high dose group (400 mg·kg-1).Fig.4 TGF-β1 protein expression in kidney tissues of six groups of rats (×400)

A.正常對照組；B.模型對照組；C.辛伐他汀組；D.HLF小劑量組(100 mg·kg-1)；E.HLF中劑量組(200 mg·kg-1)；F.HLF大劑量組(400 mg·kg-1)。①與正常對照組比較，t=11.938，11.423，P<0.05；②與模型對照組比較，t=-9.635～-2.544，P<0.05；③與辛伐他汀組比較，t=-2.203～-2.110，P<0.05；④與HLF小劑量組比較，t=-2.518，-3.982，P<0.05。圖5 6組大鼠腎臟組織中MCP-1和TGF-β1蛋白表達的比較±s，n=5) A.normal control group；B.model control group；C.simvastatin group；D.HLF low dose group (100 mg·kg-1)；E.HLF medium dose group (200 mg·kg-1)；F.HLF high dose group (400 mg·kg-1).① Compared with normal control group，t = 11.938，11.423，P<0.05；②Compared with model control group，t=-9.635--2.544，P<0.05；③ Compared with simvastatin group，t=-2.203--2.110，P<0.05；④Compared with HLF low dose group，t=-2.518，-3.982，P<0.05.Fig.5 Comparison of MCP-1 and TGF-β1 protein expression in kidney tissues among six groups of ±s，n=5)

2.7HLF對高脂血癥大鼠腎臟組織中NF-κB P65、MCP-1以及TGF-β1蛋白表達的影響(Western blotting法檢測) 模型對照組與正常對照組比較，NF-κB P65、MCP-1與TGF-β1表達明顯增加(P<0.05)，辛伐他汀組與HLF組較模型對照組蛋白表達均有所降低，且與劑量呈相關性。結(jié)果見圖6。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.辛伐他汀組；D.HLF小劑量組(100 mg·kg-1)；E.HLF中劑量組(200 mg·kg-1)；F.HLF大劑量組(400 mg·kg-1)。①與正常對照組比較，t=4.468～5.542，P<0.05；②與模型對照組比較，t=-5.476～-2.219，P<0.05；③與HLF小劑量組比較，t=-2.498，-2.696，P<0.05。圖6 6組大鼠腎臟組織中NF-κB P65、MCP-1及TGF-β 1蛋白表達的比較±s，n=4) A.normal control group；B.model control group；C.simvastatin group；D.HLF low dose group (100 mg·kg-1)；E.HLF medium dose group (200 mg·kg-1)；F.HLF high dose group (400 mg·kg-1).① Compared with normal control group，t=4.468-5.542，P<0.05；② Compared with model control group，t=-5.476--2.219，P<0.05；③ Compared with HLF low dose group，t=-2.498，-2.696，P<0.05.Fig.6 Comparison of the expression of NF-κB P65，MCP-1 and TGF-β1 in kidney tissues among six groups of ±s，n=4)

3 討論

長期高脂飲食會導致脂質(zhì)代謝紊亂，進一步引起腎臟結(jié)構(gòu)改變與功能損傷，包括腎小球肥大，基底膜、系膜基質(zhì)擴張和腎臟炎癥發(fā)生，這些改變可導致腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化[6]。本實驗模型對照組大鼠血漿中的TG、TC、LDL-C明顯增加，說明成功建立了高脂血癥模型[7]，HE染色結(jié)果顯示模型對照組大鼠腎臟組織中腎小球增大，單核細胞浸潤，基質(zhì)增厚，腎小球出現(xiàn)肉眼可見的纖維化，說明高脂血癥能對大鼠腎臟組織造成損傷。

高脂血癥與氧化應激密切相關，當機體脂質(zhì)代謝紊亂時使得體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除失衡，產(chǎn)生過多的氧自由基。SOD和GSH-Px屬于酶抗氧化系統(tǒng)，其含量降低表明機體受到氧化應激反應。本實驗結(jié)果表明，模型對照組血漿中SOD和GSH-Px含量明顯降低，而給予不同劑量HLF后SOD和GSH-Px含量較模型對照組增加，表明HLF具有一定的抗氧化作用。MDA屬于非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，MDA過多會引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，因此可以反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，從而間接反映機體受自由基攻擊的嚴重程度。本研究表明，模型對照組中MDA含量明顯升高，給予HLF不同劑量后MDA含量有所降低，說明HLF可能具有保護細胞的作用。基于以上實驗結(jié)果可說明HLF保護腎損傷可能與其抗氧化有關，但具體的機制還需進一步探討。

血脂異常可促進腎臟疾病的進展，而炎癥是高脂血癥引起腎臟疾病的重要因素之一，其病變機制可能與脂質(zhì)蓄積引起脂質(zhì)代謝紊亂有關，脂質(zhì)可作為炎癥的介導[8]，其中IL-1β、IL-6和TNF-α是最主要的促炎因子[9]。本實驗給予不同劑量HLF，可有效降低高脂飲食大鼠TG、TC和LDL-C，且能降低IL-1β、IL-6和TNF-α表達，說明HLF能降低血脂且具有一定的抗炎作用。腎纖維化是由多個炎癥細胞和細胞因子信號傳導途徑相互作用的結(jié)果，其中關鍵的纖維化因子包括MCP-1、TGF-β1、NF-κB和TNF-α[10]。NF-κB被認為是與炎癥相關的主要信號通路，可調(diào)控MCP-1和TGF-β1[11]。MCP-1是一種單核細胞趨化因子，高脂飲食導致的腎臟損傷時腎臟組織中MCP-1與TGF-β1mRNA表達增高，MCP-1及其趨化受體因子受體2(chemokine receptor 2，CCR2)因其在介導慢性腎臟疾病中具有重要的作用而得到了廣泛認可[12]。TGF-β1是TGF-β的最主要亞型，在腎纖維化中是重要的炎癥/細胞驅(qū)動因子，在許多疾病模型中，可以通過抑制TGF-β1/Smad信號傳導而減輕腎損傷和纖維化[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂血癥大鼠腎臟組織中出現(xiàn)明顯的纖維化，且其MCP-1、TGF-β1和NF-κB的表達均有所增加，說明高脂血癥可能會促進腎臟的纖維化。不同劑量HLF均可以降低MCP-1、TGF-β1和NF-κB的表達，減輕腎臟的纖維化，其作用機制與炎癥有關，但具體機制有待進一步研究。

目前，調(diào)血脂藥物主要以辛伐他汀為主，其用途較廣，但不良反應較嚴重，且耐受性較差，因此，研發(fā)更安全有效的調(diào)血脂藥物具有重要的意義。HLF作為山楂葉主要活性成分之一，低毒安全，藥理作用廣泛，對糖尿病腎病和腎缺血-再灌注損傷等具有良好的保護作用[3]，其機制可能是通過調(diào)控糖尿病腎病腎組織p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號轉(zhuǎn)導通路從而改善氧化應激對腎組織的損傷發(fā)揮作用[14]。本研究顯示，HLF能有效降低高脂飲食大鼠的血脂，且降低機體的氧化應激水平，減少炎癥因子的釋放，這可能與HLF抑制NF-κB P65、MCP-1以及TGF-β1在腎臟中的表達有關，與相關研究結(jié)果相符[15]。

綜上所述，長期高脂飲食會導致大鼠的血脂升高，腎臟組織損傷，出現(xiàn)腎臟纖維化；HLF通過其抗氧化功能和炎癥調(diào)節(jié)作用以調(diào)控MCP-1與TGF-β1信號通路，從而緩解腎組織損傷，減輕腎臟的纖維化。深入研究HLF對高脂飲食人群腎臟的保護作用將為臨床防治腎臟損傷提供新的解決思路。