柚皮素與卡馬西平共晶的紅外光譜與拉曼光譜分析*

冀威文，周健，謝逸菲，張寶喜，楊世穎，呂揚

(北京協和醫學院、中國醫學科學院藥物研究所晶型藥物研究北京市重點實驗室，北京 100050)

藥物共晶是由藥物活性成分(active pharmaceutical ingredient，API)和共晶形成物(cocrystal former，CCF)以氫鍵或其他非共價鍵結合形成的固態晶體[1]。與固體藥物的其他形態一樣(多晶型、鹽、水合物或溶劑化物)，共晶的形成能有效改善藥物的理化性質、生物利用度、穩定性和加工性能[1-2]。此外，藥物共晶還能產生藥理協同或互補作用，這也為共晶藥物的研發賦予了更大的前景與潛力。

確證共晶形成的關鍵是證實API與CCF分子間形成了非共價相互作用(氫鍵、π-π共軛作用等)，最準確的技術手段是單晶X射線衍射法，但該方法前提是必須獲得適合衍射實驗用的單晶體，且對晶體的尺寸、結晶度和完整度都有較高要求，因此，對于不易結晶的共晶物質成為制約其確證表征的難題[3]。紅外光譜(infrared spectroscopy，IR)和拉曼光譜(Raman)等光譜技術由于能夠探知官能團的分子作用力變化，在藥物共晶研究中應用越來越廣泛。兩種光譜技術原理不同，形成有力互補，同時兩種光譜技術還具有對樣品無損傷、測試簡單快速等優點[4]。目前，紅外光譜和拉曼光譜均屬于《中華人民共和國藥典》2020年版四部9015藥品晶型研究及晶型質量控制指導原則中收載的用于晶型與共晶研究的檢測分析技術方法。傅里葉變換紅外光譜法(Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR)是依據分子內部原子間相互振動以及分子轉動等信息來推測被測物分子結構的一類分析方法[5]，已被各國藥典收載用于藥物晶型的檢測分析。張慧麗等[6]用固體研磨的方法制備由吡拉西坦和3-羥基苯甲酸作為原料藥的藥物共晶體，紅外光譜、拉曼光譜和太赫茲光譜(THz)表征結果均表明共晶體的振動模式與原料藥有顯著區別；拉曼光譜則由分子極化率變化產生[7]，在紅外光譜中難以反映的振動在拉曼光譜中很強，故紅外光譜和拉曼光譜常常聯合應用于晶型樣品的定性分析[8]。王琪琪等[9]研究發現拉曼光譜技術可以有效鑒別吡嗪酰胺、2，5-雙羥基苯甲酸及其共晶體，并證明共晶之間存在的相互作用和其內部晶格振動改變導致一系列圖譜的峰數量或峰裂分、峰位置以及峰強度或峰形拓撲等方面產生了變化。

柚皮素屬二氫黃酮類化合物，因其具有抗炎[10]、抗腫瘤[11]、抗焦慮[12]、降血脂[13]以及抗纖維化[14]等作用，被廣泛關注并應用于醫藥、食品等領域；卡馬西平屬二苯并氮雜類抗癲癇藥，臨床上被應用于緩解耳鳴或三叉神經痛，預防或治療躁狂癥或抑郁癥[15]。二者若能形成共晶，不僅可能改善溶解性，還有可能產生藥理協同作用。2019年LEE等[16]獲得了柚皮素與卡馬西平共晶，并采用單晶X射線衍射法、粉末X射線衍射法(powder X-ray diffraction，PXRD)、差示掃描量熱法、熱重分析法對該共晶進行了表征，但未開展柚皮素與卡馬西平共晶物的光譜分析研究。

筆者采用紅外光譜和拉曼光譜系統分析了柚皮素與卡馬西平共晶物、柚皮素、卡馬西平三者之間的光譜特征與區別差異，重點對柚皮素與卡馬西平共晶物的分子間作用力進行研究，從不同角度探究其共晶的形成機制。

1 材料與方法

1.1儀器 D/max2550粉末X射線衍射儀(日本Rigaku公司)；Horiba HR evolution高分辨拉曼光譜儀 (法國HORIBA公司)；Spectrum 400型傅里葉變換紅外光譜儀(美國PerkinElmer公司)。

1.2試藥 柚皮素(陜西惠科植物開發有限公司，含量：98.0%，批號：20190703)；卡馬西平(武漢遠成共創科技有限公司，含量：100.3%，批號：20190329)；乙酸乙酯(福晨化學時間有限公司，AR級，批號：20190804)。

1.3共晶樣品制備 按照摩爾比1：1分別稱取柚皮素、卡馬西平的原料藥13.6，11.8 mg，置于晶體生長管中，加入乙酸乙酯200 μL，放入轉子，置于磁力攪拌器400 r·min-1，攪拌48 h，之后將其放入40 ℃真空干燥箱內干燥12 h，即得柚皮素與卡馬西平共晶，對所得樣品進行PXRD分析，將PXRD實驗圖譜與理論圖譜進行比對，確證共晶物的形成。

1.4共晶樣品表征 PXRD測試條件為：Cu 靶，電壓40 kV，電流40 mA，測試角度范圍3°～40°，取樣品適量分別進行PXRD分析；紅外光譜分析采用傅里葉變換紅外光譜儀，儀器分辨率為4 cm-1，掃描次數16次，壓力值80 Pa；拉曼光譜分析采用拉曼光譜儀，使用激光光源波長為633 nm，光柵600 gr·mm-1，累積時間3 s，累計次數3次。

2 結果

2.1柚皮素與卡馬西平共晶的確證分析 柚皮素、卡馬西平、柚皮素與卡馬西平共晶的粉末圖譜見圖1。對比可見，共晶與API和CCF粉末衍射圖譜中特征峰發生明顯改變，峰位以及峰形完全不同。共晶化合物在2θ=5.46°，6.80°，16.52°，18.24°，24.42°出現了新的衍射峰，柚皮素11.52°，15.84°和卡馬西平10.10°，15.39°的特征峰消失。PXRD圖譜結果提示，柚皮素和卡馬西平之間形成了新的共晶物。共晶物的實驗PXRD圖譜與已獲得單晶的理論PXRD圖譜比對一致，證明獲得的實驗樣品為晶型純度較高的柚皮素與卡馬西平共晶物。

圖1 理論共晶(A)、實驗共晶(B)、卡馬西平(C)和柚皮素(D)的PXRD圖譜 Fig.1 Powder X-ray diffraction patterns of theoretical cocrystal (A)，experimental cocrystal (B)，carbamazepine (C) and naringin (D)

2.2柚皮素與卡馬西平共晶的紅外光譜分析 柚皮素、卡馬西平、柚皮素與卡馬西平共晶物的紅外光譜疊合圖見圖2。對比三者的紅外特征峰可發現，共晶的各個吸收峰都產生了不同程度的位移現象，本文主要針對波數在3500～3000 cm-1的氫原子的伸縮振動和波數在1700～700 cm-1的羰基的伸縮振動和氫原子彎曲振動進行研究，氫鍵的形成可使分子中的X-H鍵(X=C、N、O)的振動頻率改變，由于分子的締合，使電子云密度平均化，從而使氫原子的伸縮振動頻率降低且峰變寬，對于氫原子的彎曲振動，則會產生相反的效果。

圖2 共晶(A)、卡馬西平(B)和柚皮素(C)的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of cocrystal (A)，carbamazepine (B) and naringin (C)

卡馬西平紅外光譜中歸屬為N-H伸縮振動峰位于3464 cm-1處，在共晶中該特征吸收峰向低頻方向位移至3420 cm-1處，圖譜中卡馬西平歸屬為N-H彎曲振動峰位于1593 cm-1處，在共晶中的特征吸收峰向高頻方向移至1646 cm-1處，且卡馬西平在1677，1604 cm-1的νC=O-R、νC=O伸縮振動峰在共晶中的特征吸收峰向1675 cm-1處移動。另外，卡馬西平的γN-H吸收峰原本在762 cm-1處，因氫鍵的作用向高頻段806 cm-1處移動，說明卡馬西平的C=O和-NH2共同參與了共晶的形成。柚皮素紅外光譜中歸屬為O-H伸縮振動峰位于3267 cm-1處，由于共晶中氫鍵的作用使其特征吸收峰向低頻方向位移至3199 cm-1，且圖譜中柚皮素歸屬為O-H彎曲振動峰位于1246，1153 cm-1處，在共晶中的特征吸收峰向高頻方向移至1421cm-1處，說明參與形成氫鍵的基團應該是-OH。卡馬西平和柚皮素中都存在羰基的伸縮振動峰，但分析發現只有卡馬西平的νC=O峰由于氫鍵影響從1675 cm-1向低頻1677 cm-1移動，共晶中歸屬為NAR的νC=O峰則與其本身的峰位置基本一致，表明柚皮素的C=O鍵中的振動峰從1599 cm-1向低頻1600 cm-1移動，沒有明顯參與共晶氫鍵的形成(表1)。綜上所述，由紅外吸收光譜推測分析可知，柚皮素和卡馬西平之間由于 OH…O、NH…O相互作用，形成共晶。

表1 柚皮素、卡馬西平和柚皮素與卡馬西平共晶的紅外光譜特征 Tab.1 Infrared spectral characteristics of naringin，carbamazepine and their cocrystal cm-1

2.3柚皮素與卡馬西平共晶的拉曼光譜分析 柚皮素、卡馬西平、柚皮素與卡馬西平共晶物的拉曼光譜見圖3。對照可以發現，柚皮素與卡馬西平共晶分子的拉曼特征峰相較原料藥的拉曼特征峰有了明顯的拉曼位移，原料藥的一些特征峰出現了減弱乃至消失的變化。對比共晶，值得關注的是1000～800 cm-1波數范圍內的變化，此范圍被定義為芳環的骨架振動、CH變形和環變形波段[17]，柚皮素原料藥的拉曼特征峰為712.19 cm-1，卡馬西平原料藥的拉曼特征峰為698.22 和723.20 cm-1，成共晶后特征峰發現該處并沒有明顯的拉曼信號，這表明共晶中的苯環周圍可能存在如π-π堆積的弱相互作用[18]。拉曼圖譜的1800～1400 cm-1波數范圍歸屬為羰基和酰胺基團吸收，柚皮素原料藥的νC=O振動峰在1588.01 和1618.79 cm-1處，卡馬西平原料藥的酰胺譜帶有1564.78 cm-1(δCN)、1600.02 cm-1(δNH)和1622.53 cm-1(νC=O)處，在共晶中的特征吸收峰由于氫鍵的形成向低頻方向移至1561.62，1597.51 和1619.42 cm-1。總體來說拉曼光譜在對比內部結構和分子振動方面更側重于非極性基團的分析，特別是苯環振動區有明顯變化，從而更加全面地探索了柚皮素與卡馬西平共晶的形成機制。

圖3 共晶(A)、卡馬西平(B)、柚皮素(C)的拉曼圖譜 Fig.3 Raman spectra of cocrystal (A)，Carbamazepine (B) and Naringin (C)

根據柚皮素與卡馬西平共晶的單晶X射線衍射分析結果[16]，卡馬西平分子的酰胺基團扮演著供體和受體角色，它與兩個柚皮素分子形成兩種不同的氫鍵，柚皮素間苯二酚基團與兩個卡馬西平分子的-NH2形成氫鍵，與本文得出紅外圖譜中共晶對比柚皮素的-OH特征峰和CBZ的-NH2特征峰產生偏移，拉曼圖譜中共晶對比原料藥苯環振動區和酰胺譜帶變化的結果一致，表明兩種光譜有鑒別分析和闡明氫鍵形成機制的能力。

3 討論

柚皮素分子結構為黃酮母核，在5位、7位和4′位含有3個酚羥基，4位羰基常與5位酚羥基形成分子內氫鍵，其與7位、4′位酚羥基均是形成超分子化合物的活性基團。從柚皮素目前已報道的共晶物[16，19-22]來看，柚皮素可通過7位酚羥基、4位羰基和苯環上4′位酚羥基與含有酰胺、脲、胺、吡啶或羰基的CCF形成氫鍵，氫鍵是超分子化學的主要作用力之一。卡馬西平是兩個苯環并氮雜的酰胺類化合物，既充當氫鍵受體又能充當氫鍵供體。不同的官能團和化學鍵的紅外與拉曼頻率具有其特征，這些官能團和化學鍵的特征頻率在共晶形成的過程中由于分子間的作用力(主要表現為氫鍵的作用)的變化，常常也會發生不同程度的偏移[8，23]。紅外光譜與拉曼光譜均屬于振動光譜，紅外光譜源于分子偶極距變化，對分子中的極性基團常常具有較強的吸收；而拉曼光譜則由分子極化率變化產生，對分子中的非極性基團具有更好的特征性，兩種光譜相互補充，從不同角度展示了共晶物分子結構的振動信息及分子作用力的變化，為探求共晶形成機制提供了有效的技術手段。

筆者采用紅外光譜和拉曼光譜相結合的分析方法，對懸浮液法制備所得的柚皮素與卡馬西平共晶進行表征，并對不同物相體系中分子的特征峰振動模式進行歸屬。紅外光譜分析結果表明，柚皮素與卡馬西平共晶中特征基團的紅外吸收峰，如-OH伸縮振動峰和-C-N伸縮振動峰等，較柚皮素和卡馬西平而言均發生了較大波數的峰位偏移，同時伴隨著峰寬和峰強度的變化；拉曼光譜分析結果也顯示柚皮素和卡馬西平共晶中，二者分子之間存在氫鍵、π-π堆積等相互作用力，光譜分析的結果與單晶X射線衍射分析結果一致，從而佐證了共晶物兩種組分間的分子作用方式以及共晶形成機制。可見，對于難以獲得單晶結構的共晶物，使用紅外光譜與拉曼光譜相結合的方法可以進行共晶分子作用力的分析，并能夠顯示出一定的技術優勢。在藥物共晶研究過程中，通過多種不同原理的分析技術，可以從不同角度進行表征分析，為闡明共晶形成機制與特點提供較全面的、多維度的科學依據。