基于熱分析技術的白樺脂醇多晶型發現與表征*

劉琪文，陳婷，安琪，楊世穎，楊德智，呂揚，杜冠華

(北京協和醫學院、中國醫學科學院藥物研究所1.晶型藥物研究北京市重點實驗室；2.藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室，北京 100050)

白樺脂醇(betulin)又名白樺酯醇、樺木醇、樺木腦，是從白樺樹皮中提取的一種五環三萜類化合物，分子式為C30H50O2，分子量為442.38。白樺脂醇具有廣泛的藥理作用，如降血糖、抗炎、抑菌及抗癌等[1-5]，但水溶性差，生物利用度低，限制了其進一步研究與臨床應用。固體化學藥物存在多晶型現象，同種物質的不同晶型由于排列方式和排列規律不同，其理化性質、生物利用度和藥理性質等可能不同[6]。通過對固體化學藥物進行多晶型研究，可發現藥物的不同晶型，從而探究穩定性較好、生物利用度高且安全有效的優勢藥物晶型[7]。白樺脂醇已有11種溶劑合物[8-11]和1種白樺脂醇半水合物報道[12]。本課題組在中國專利CN109988215A中公布了白樺脂醇晶B型[13]，專利CN109988214A中公布了白樺脂醇晶C型[14]，專利CN109988216A中公布了白樺脂醇晶D型[15]。通過對市售的白樺脂醇進行粉末X射線衍射法(powder X-ray diffraction，PXRD)表征，發現其PXRD圖譜與已報道白樺脂醇的多晶型圖譜不一致，故將其命名為晶A型。在本研究中，采用晶A型作為起始晶型，研究白樺脂醇的3種無溶劑的晶B型、晶C型、晶D型制備方法。在此基礎上，對4種晶型進行差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry，DSC)、熱重法(thermogravimetry，TG)、PXRD表征以及溶解度、穩定性的評價研究工作。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與試藥 白樺脂醇購自南京澤朗醫藥科技有限公司(含量>99%)；高效液相色譜法(HPLC)使用的溶劑為色譜純，購自美國Fisher公司；其他試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水為純凈水。

1.1.2儀器 差示掃描量熱儀(DSC1型，瑞士Mettler Toledo公司)；熱重分析儀(TGA/DSC1型，瑞士Mettler Toledo 公司)；粉末X射線衍射儀(Rigaku D/max-2550，日本理學 Rigaku 公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9035A，上海一恒科技有限公司)；溶出實驗儀(RC12AD型，天大天發有限公司，配 RZQ-12D 取樣收集系統)；高效液相色譜儀(Agilent 1200，美國Agilent 公司，配 DAD檢測器)。

1.2實驗方法

1.2.1多晶型制備 依據白樺脂醇晶A型的DSC圖譜，分別選擇160，220 ℃作為多晶型篩選及制備的溫度。取白樺脂醇原料藥適量，將其置于160 ℃的干燥箱中，加熱后得到無溶劑的晶B型；將晶B型置于220 ℃的干燥箱中，加熱后得到晶C型；晶C型可通過加熱熔融或者研磨法得到晶D型。

1.2.2DSC分析與TG分析 DSC分析：精密稱取樣品3～5 mg，置于40 μL標準帶蓋鋁坩堝中，用空鋁坩堝做參比，在大氣氣氛下設置升溫速率為10 ℃·min-1，采用STARe數據處理軟件處理圖譜。

TG分析：精密稱取樣品3～5 mg，置于氧化鋁坩堝(6.0 mm×4.5 mm)中，在50 mL·min-1的氮氣保護下設置升溫速率為10 ℃·min-1，掃描范圍：30～500 ℃，采用STARe數據處理軟件處理圖譜。

1.2.3PXRD分析 使用粉末X射線衍射儀對白樺脂醇4種晶型以及穩定性實驗樣品進行PXRD表征，實驗條件：CuKα輻射，λ=1.541 84?，管壓40 kV，管流150 mA，2θ掃描范圍在3°～80°，步長0.02°，掃描速度為8°·min-1。

1.2.4穩定性考察 按穩定性考察要求，稱取白樺脂醇4種晶型樣品各50 mg，置于培養皿中，每個樣品3份，分別置于高溫[(60±1 ) ℃] 、高濕[(90±5)%，25 ℃]、光照[(4500±500) lx，25 ℃]條件下，并于第0天、第5天和第10天取樣。利用PXRD測定第5天、第10天的樣品，掃描范圍為3°～80°，并與原始數據進行比較，作為考察4種晶型穩定性的依據。

1.2.5溶解性評價 采用HPLC法對白樺脂醇4種晶型進行溶解度考察實驗。HPLC實驗條件為：色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相：乙腈：水(V：V)=90：10。流速：1.0 mL·min-1，柱溫：30 ℃，進樣量：10 μL。檢測波長：210 nm。

2 結果

2.1DSC與TG測定結果 在程序控溫下，DSC可測量物質的能量與溫度變化的關系，TG可檢測物質的質量與溫度變化的關系[16]。相同物質的不同晶型的熱力學行為一般不同，可通過DSC和TG進行測定，綜合分析后區分不同晶型。

在白樺脂醇晶A型的DSC圖譜中存在3個吸熱峰，其中前兩個吸熱峰峰形較寬，峰值溫度(PEAK)值分別為95.9，203.3 ℃；第3個吸熱峰較尖銳，PEAK值為260.5 ℃(圖1)。晶A型的TG圖譜(圖2)顯示，在50～150 ℃范圍內存在一個0.67%的失重臺階，該范圍與其DSC圖譜中第1個吸熱峰的溫度(95.9 ℃)對應，從而確定白樺脂醇晶A型含有少量溶劑且其DSC的第1個吸熱峰為溶劑峰。

將白樺脂醇晶A型置于160 ℃(其第1個吸熱峰95.9 ℃和第2個吸熱峰203.3 ℃溫度之間)干燥箱中加熱去溶劑，得到晶B型。晶B型DSC圖譜中含有2個吸熱峰，其PEAK值分別為204.1，260.3 ℃；其TG圖(圖2)只有一個失重臺階，為不含溶劑的白樺脂醇。故推斷晶B型的DSC圖譜中第1個吸熱峰(204.1 ℃)為轉晶點，第2個吸熱峰(260.3 ℃)為熔融過程。選擇在220 ℃時將晶B型加熱，獲得了晶C型。晶C型的DSC圖譜中只含1個尖銳的吸熱峰，其峰值為260.0 ℃；其TG圖(圖2)只有一個失重臺階，為不含溶劑的白樺脂醇。將晶C型加熱熔融或者研磨可得白樺脂醇的無定型晶D型。晶D型的DSC圖譜中存在3個放熱峰和1個吸熱峰，3個放熱峰的峰值分別為109.0，137.4和197.1 ℃，最終在260.3 ℃吸熱熔融。白樺脂醇晶D型的TG圖(圖2)只有一個失重臺階，為不含溶劑的白樺脂醇。白樺脂醇4種晶型的DSC圖譜及數據見圖1、表1，4種晶型的TG圖譜及數據見圖2、表2。

圖1 白樺脂醇4種晶型的DSC圖譜 Fig.1 DSC patterns of four crystal forms of betulin

圖2 白樺脂醇4種晶型的TG圖譜 Fig.2 TG patterns of four crystal forms of betulin

表1 白樺脂醇4種晶型的DSC數據 Tab.1 DSC data of four crystal forms of betulin

表2 白樺脂醇4種晶型的TG數據 Tab.2 TG data of four crystal forms of betulin

2.2PXRD分析 PXRD是定性和定量研究藥物多晶型的重要方法[17]，同種物質不同晶型的粉末圖譜會有不同位置和強度的衍射峰。將白樺脂醇4種晶型的實驗粉末圖進行比較，結果見圖3所示。由圖3可知，與晶A型相比，晶C型衍射峰較為尖銳，且衍射峰位置增加、強度發生變化，與晶A型存在較大差異，為新晶型；晶D型為無定型，僅存在一個彌散衍射峰；晶B型與晶A型粉末圖相比，粉末峰變尖銳但差異不明顯，需結合其他表征手段加以區分。

圖3 白樺脂醇4種晶型的PXRD圖譜 Fig.3 PXRD patterns of four crystal forms of betulin

2.3穩定性評價 將白樺脂醇4種晶型樣品放置于高濕、高溫、光照條件下，分別于5，10 d后取出，通過PXRD表征以判斷4種晶型的穩定性。結果顯示，晶A型、晶B型、晶C型及晶D型均可以穩定存在，為白樺脂醇的穩定晶型。

2.4溶解度評價 采用HPLC對白樺脂醇4種晶型的溶解度進行測定，由于白樺脂醇屬于難溶性藥物，在水、pH值6.8磷酸緩沖液、0.9%鹽酸中均不溶解(未檢測到白樺脂醇)，故使用0.5%十二烷基硫酸鈉溶液進行實驗，增加白樺脂醇的溶解度，以對白樺脂醇不同晶型的溶解度進行區分。以時間為橫坐標，白樺脂醇的溶解度為縱坐標繪制溶解度曲線(圖4)。結果表明，在0.5%十二烷基硫酸鈉溶液中，晶A型溶解度最差，新獲得的3種晶型溶解性和溶解性質都有提高。其中，晶D型具有最明顯的溶解性優勢，溶解速率最快，溶解度最好；晶B型與晶C型相似，溶解速率雖不及晶D型，但均優于晶A型。結合4種晶型的穩定性性質，確定晶D型為優勢藥用晶型。

圖4 白樺脂醇4種晶型在0.5%十二烷基硫酸鈉溶液中的溶出曲線 Fig.4 Dissolution curves of four crystal forms of betulin in 0.5% SDS

3 討論

本研究通過對白樺脂醇晶A型的熱力學行為進行分析，采用加熱法和研磨法對白樺脂醇進行多晶型篩查，最終得到3種不含溶劑的晶型，即晶B型、晶C型、晶D型。其中晶D型在0.5%十二烷基硫酸鈉中溶解性最好，且在穩定性實驗考察條件下可以保持無定型狀態，故將晶D型確定為白樺脂醇的優勢藥用晶型。本研究基于對藥物的熱力學性質進行分析后進行多晶型篩查，相比于傳統篩查方式，本方法更具有目標性，提高了晶型篩查效率，縮短藥物多晶型篩查的研究周期，可以加快藥物多晶型研究和藥用開發。