白芥子散的質量標準研究*

范曉良，張純，郭志麗，阮偉峰，方瑞華

(1.浙江中醫藥大學附屬嘉興中醫院藥學部，嘉興 314001；2.嘉興市感染性疾病及細菌耐藥研究重點實驗室，嘉興 314001；3.嘉興市食品藥品與產品質量檢驗檢測院中藥室，嘉興 314001)

白芥子散源自清代張璐所著《張氏醫通》[1]，是臨床上廣泛用于防治哮喘的穴位貼敷基本方。經臨床實踐，多數患者(包括兒童)經貼敷治療后體質有不同程度改善[2]。現代研究表明，其可有效調解抑制Th2反應，降低血清中單核細胞趨化蛋白1、白細胞介素4、白細胞介素13、免疫球蛋白和腫瘤壞死因子水平，使Thl/Th2趨于平衡而起到防治哮喘的功效[3-5]。

該方藥在臨床應用過程中常引起皮膚變態反應，除與貼敷時間、患者體質等因素相關外[6-7]，與其自身藥物質量也有重大關系，但目前對該方藥的研究多集中于臨床應用、療效機制、制劑改進[8]等方面，而對其質量控制方面的研究卻鮮有報道。有人僅以薄層色譜法鑒別了其中部分藥物，或僅建立了某個單一成分的測定方法[9-10]。另外，在穴位貼敷干預哮病的中醫治未病實踐指南中[11]，雖明確推薦了該方藥的組成(白芥子、延胡索、細辛、甘遂)，比例及制備工藝，但未對其質量標準作出要求。故對其進行全面質量控制，建立完善的質量標準對保障其臨床用藥安全具有重要意義。本研究除對白芥子散的水分、總灰分進行測定外，建立了白芥子等4味藥物的顯微、薄層鑒別法及芥子堿硫氰酸鹽、細辛脂素兩個主要成分的同時測定方法，為建立白芥子散的質量標準提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Eclipse E200MV型生物顯微鏡(日本尼康公司)；Waters E2695-2998高效液相色譜系統，DAD檢測器(美國WATERS公司)；XS205DU型電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司，感量：0.01 mg)；Mili-Q Reference超純水系統(美國MILLIPORE公司)；USC-502 型超聲波清洗器(上海波龍電子設備有限公司)；硅膠G薄層板(德國默克公司)等。

1.2試藥 芥子堿硫氰酸鹽(含量：98.6%，批號：AF8100802)、細辛脂素(含量：98.9%，批號：AF8031912)、大戟二烯醇(含量：98.5%，批號：18041403)均購自于成都埃法生物科技有限公司；延胡索乙素(含量99.8%，批號：110726-201516)、延胡索對照藥材(批號：120928-201609)、細辛對照藥材(批號：121204-201606)、甘遂對照藥材(批號：121042-201605)均購自于中國食品藥品檢定研究院。白芥子散(12批樣品均為自制，批號分別為180712，180713，180717，180720， 180723， 180724， 180726，180727，180802，180807，180810，180812)。白芥子、延胡索、細辛、甘遂藥材均由嘉興東方國藥飲片有限公司提供(批號分別為181102，190226，190323，181209)，經嘉興市食品藥品與產品質量檢驗檢測院陳葉青副主任中藥師鑒定為《中華人民共和國藥典》規定品種。

2 方法與結果

2.1水分及總灰分 參照《中華人民共和國藥典》2015年版四部0832項下第二法(烘干法)及灰分測定法下的第一項“總灰分測定法”分別進行實驗[12]，各平行操作3次，取平均值。結果顯示12批白芥子散的水分含量為9.9%～14.8%，平均值為11.82%；總灰分為2.5%～3.7%，平均值為3.14%。

2.2顯微鑒別 取樣品細粉適量制片，置顯微鏡下觀察。可見白芥子種皮柵狀細胞成片，表面觀呈類多角形，常與下皮細胞重疊；延胡索的糊化淀粉粒團塊，多數呈類圓形；大量細辛草酸鈣砂晶存在，測得直徑約5 μm；甘遂細長木纖維明顯，扭曲狀。12批次樣本中均可見上述顯微特征，見圖1。

A.種皮柵狀細胞(白芥子)；B.糊化淀粉粒(延胡索)；C.草酸鈣砂晶(細辛)；D.木纖維(甘遂)。圖1 白芥子散顯微鑒別(40×10) A.seed coat palisade cells (Semen Sinapis Albae)；B.gelatinized starch granules (Corydalis Rhizoma)；C.calcium oxalate sand crystals ( Asari Radix et Rhizoma)；D.wood fiber (Kansui Radix).Fig.1 Microscopic characteristics of Baijiezi San(40×10)

2.3薄層色譜鑒別

2.3.1白芥子的薄層鑒別 取批號為180712的白芥子散粉末3.5 g，加甲醇50 mL，30 ℃恒溫條件下超聲(250 W，50 kHz)處理1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 mL溶解，作為供試品溶液；取除白芥子的其他藥材，按比例制備成缺白芥子的陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法制成缺白芥子陰性溶液；取白芥子對照藥材1.0 g，同法制成白芥子對照藥材溶液；另取芥子堿硫氰酸鹽對照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述溶液各5～10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(3.5：5：1：0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液，置日光下檢視。結果見圖2。

1.白芥子對照藥材；2.芥子堿硫氰酸鹽；3.供試品；4.陰性樣品。圖2 白芥子薄層色譜圖 1.reference drug of Semen Sinapis Albae；2.sinapine thiocyanate；3.sample；4.negative sample.Fig.2 TLC chromatogram of Semen Sinapis Albae

2.3.2延胡索的薄層鑒別 取批號為180712的白芥子散粉末5.0 g，加甲醇50 mL，30 ℃的恒溫條件下超聲(250 W，50 kHz)處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL溶解，加濃氨試液調至堿性，用乙醚振搖提取3次，每次10 mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液；取除延胡索的其他藥材，按比例制備成缺延胡索的陰性對照樣品，并按供試品溶液制備方法制成缺延胡索陰性溶液；同時另取延胡索對照藥材1.0 g，同法制成延胡索對照藥材溶液；再取延胡索乙素對照品，加甲醇制成每毫升含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。吸收上述溶液各2～3 μL，分別點于同一用G薄層板上，以甲苯-丙酮(9：2)為展開劑，展開，取出，晾干，以碘蒸汽熏至顯色，置紫外光燈(365 nm)下檢視。結果見圖3。

1.延胡索對照藥材；2.延胡索乙素；3.供試品；4.陰性樣品。圖3 延胡索薄層色譜圖 1.reference drug of Corydalis Rhizoma；2.tetrahydropalmatine；3.sample；4.negative sample.Fig.3 TLC chromatogram of Corydalis Rhizoma

2.3.3細辛的薄層鑒別 取批號為180712的白芥子散粉末3.5 g，加甲醇20 mL，30 ℃的恒溫條件下超聲(250 W，50 kHz)處理45 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL溶解，作為供試品溶液；取除細辛的其他藥材，按比例制備成缺細辛的陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法制成缺細辛陰性溶液；另取細辛對照藥材1.0 g，同法制成對照藥材溶液。再取細辛脂素對照品加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)乙酸乙酯(4：1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，放置于105 ℃至斑點顯色清晰。結果見圖4。

1.細辛對照藥材；2.細辛脂素；3.供試品；4.陰性樣品。圖4 細辛薄層色譜圖 1.reference drug of Asari Radix et Rhizoma；2.Asarinin；3.sample；4.negative sample.Fig.4 TLC chromatogram of Asari Radix et Rhizoma

2.3.4甘遂的薄層鑒別 取批號為180712的白芥子散粉末3.5 g，加乙醇10 mL，30 ℃的恒溫條件下超聲(250 W，50 kHz)處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1 mL溶解，作為供試品溶液；取除甘遂的其他藥材，按比例制備成缺甘遂的陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法制成缺甘遂陰性溶液；另取甘遂對照藥材1.0 g，同法制成對照藥材溶液；再取大戟二烯醇對照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60 ℃)-丙酮(10：1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結果見圖5。

1.甘遂對照藥材；2.大戟二烯醇；3.供試品；4.陰性樣品。圖5 甘遂薄層色譜圖 1.reference drug of Kansui Radix；2.euphadienol；3.sample；4.negative sample.Fig.5 TLC chromatogram of Kansui Radix

2.4定量測定

2.4.1對照品儲備液的制備 精密稱取芥子堿硫氰酸鹽、細辛脂素對照品適量，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每毫升中分別含498.82，395.14 μg的混合對照品儲備液。

2.4.2供試品溶液的制備 精密稱取批號為180712的白芥子散粉末0.5 g，置150 mL錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)40 min，取出，冷卻至室溫，加甲醇補足減失的質量。搖勻，過濾，取續濾液，離心，經孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4.3陰性樣品溶液的制備 按白芥子散處方比例，分別制備缺白芥子、細辛的陰性對照樣品，同“2.4.2”項下方法，制備陰性對照品溶液。

2.4.4色譜條件 色譜柱為X BridgeTMC18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～20 min，5%→30%A；20～50 min，30%→60%A，50～60 min，90%A)；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；樣品及對照品進樣量：10 μL；芥子堿硫氰酸鹽及細辛脂素檢測波長均為280 nm。

2.4.5專屬性實驗 分別精密吸取上述混合對照品儲備液、供試品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積。結果示目標成分的色譜峰與相鄰色譜峰分離度>1.5，表明分離良好，且混合對照品溶液及供試品溶液中芥子堿硫氰酸鹽、細辛脂素對應的保留時間處，陰性對照品溶液無吸收峰出現，因此該方法專屬性較好。見圖6。

A.缺白芥子陰性對照品溶液；B.缺細辛陰性對照品溶液；C.混合對照品溶液；D.供試品溶液。1.細辛脂素；2.芥子堿硫氰酸鹽。圖6 白芥子散高效液相色譜圖 A.negative control solution without Semen Sinapis Albae；B.negative control solution without Asari Radix et Rhizoma；C.mixed reference solution；D.sample solution；1.asarinin；2.sinapine thiocyanate.Fig.6 HPLC chromatograms of Baijiezi San

2.4.6線性關系考察 精密吸取上述混合對照品儲備液適量，分別以甲醇稀釋2倍、5倍、10倍、50倍、100倍，獲得包括對照品儲備液在內的6個不同濃度對照品液，按“2.4.4”項下色譜條件操作，以對照品濃度X(μg·mL-1)為橫坐標繪制標準曲線，以測得的峰面積Y為縱坐標，計算回歸方程分別為：芥子堿硫氰酸鹽：Y=27 564X-49 685 (r=0.999 8)；細辛脂素：Y=12 279X+7 052.4 (r=0.999 9)，表明芥子堿硫氰酸鹽、細辛脂素分別在4.99～498.82，3.951～395.1 μg·mL-1濃度范圍內線性關系良好。

2.4.7精密度實驗 在室溫條件下，取“2.4.1”項下制備的對照品儲備溶液，按“2.4.4”項下色譜條件，連續進樣6次，結果顯示芥子堿硫氰酸鹽、細辛脂素峰面積的RSD分別為0.84%和1.53%，表明儀器的精密度良好。

2.4.8重復性實驗 取白芥子散樣品(批號：180712)，按“2.4.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.4.4”項下色譜條件操作并測定峰面積，計算含量，結果芥子堿硫氰酸鹽、細辛脂素平均含量分別為2.0和0.75 mg·g-1，RSD分別為2.23%和1.06%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.4.9穩定性實驗 取同一份樣品溶液(批號：180712)，依次于樣品配制后0，6，8，12，24，36 h進樣，測定峰面積并計算RSD。結果顯示芥子堿硫氰酸鹽、細辛脂素峰面積的RSD分別為0.90%和2.25%(n=6)，表明36 h內供試品溶液的穩定性良好。

2.4.10加樣回收實驗 精密稱取已知含量的白芥子散樣品(批號：180712)9份，每份約0.25 g，分別按已知含量的50%，100%，150%加入對照品，并按照“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.4.4”項下色譜條進行測定，計算回收率。最終得芥子堿硫氰酸鹽的平均加樣回收率為99.58%，RSD為1.17%，細辛脂素的平均加樣回收率為101.92%，RSD為1.55%，表明該方法回收率良好。結果見表1。

表1 芥子堿硫氰酸鹽和細辛脂素的加樣回收率實驗結果Tab.1 Recovery test results of sinapine thiocyanate and asarinin n=9

2.4.11含量測定 取12批白芥子散樣品，按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.4.4”項色譜條件下進樣分析，記錄芥子堿硫氰酸鹽、細辛脂素峰面積并計算含量。結果見表2。

表2 12批次白芥子散芥子堿硫氰酸鹽及細辛脂素含量結果 Tab.2 Content determination results of sinapine thiocyanate and asarinin in 12 batches of Baijiezi San mg·g-1，n=9

3 討論

3.1顯微與薄層鑒別 白芥子散4種藥材的顯微特征較多，本研究選擇了白芥子(種皮柵狀細胞)、延胡索(糊化淀粉粒)、細辛(草酸鈣砂晶)、甘遂(木纖維)的特有顯微特征作為觀察要點，并同時觀察了對應的缺味陰性樣品，在陰性樣品中并未見對應藥材的特有顯微特征，表明此方法有效可行。

在白芥子、延胡索的薄層色譜鑒別過程中，展開劑的選擇參照了《中華人民共和國藥典》2020年版介紹的方法[13]，分離結果均較滿意，而在細辛及甘遂的薄層色譜鑒別中，以《中華人民共和國藥典》推薦的展開劑進行實驗時，兩者的薄層色譜斑點分離均較差。最終筆者發現以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(4：1)為展開劑時，細辛各成分分離結果令人滿意；以石油醚(30～60 ℃)-丙酮(10：1)為展開劑時，甘遂的各成分斑點分離較好。

3.2含量測定指標的選擇 白芥子散中芥子堿硫氰酸鹽目前已證實具有平喘功效[14]，為主要有效成分指標之一，而細辛脂素具有促進其他活性成分經皮滲透而利于哮喘的治療[15]，且《中華人民共和國藥典》規定，芥子堿硫氰酸鹽、細辛脂素分別是白芥子和細辛的質量控制成分，因此本研究選擇芥子堿硫氰酸鹽及細辛脂素為含量測定指標。

3.3限量標準的建議 根據測定結果及《中華人民共和國藥典》對于中藥質量標準研究制定技術要求，并結合實際情況，建議白芥子散的水分不得超過15.00%，總灰分不得超過5.00%。考慮到芥子堿硫氰酸鹽及其水解產物對皮膚有強烈的刺激反應，對其進行限量實有必要，故建議其含量不得少于2.0 mg·g-1且不得超過4.0 mg·g-1，細辛脂素含量不得少于0.60 mg·g-1，上述結論可作為白芥子散質量標準的參考依據。