宮頸病變篩查中檢測方法的聯合應用探討

李 茜，卞美璐?，馬 莉，陳 曦，袁記方，陳慶云，賀桂芳，劉紅剛

（1.中日友好醫院 婦產科，北京 100029；2.廣東省人乳頭瘤病毒HPV 相關疾病分子診斷工程技術研究開發中心，廣東廣州 521000；3.首都醫科大學附屬北京同仁醫院 病理科，北京 100730）

宮頸癌目前仍然是全球女性的第四大常見腫瘤[1]。 據報道[2]，我國每年約有新發病例13 萬，約占世界宮頸癌新發病例總數的1/4。現已明確人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染尤其是高危型HPV 持續感染是誘發宮頸癌的明確病因之一，其致癌作用與HPV DNA 和宿主DNA 的整合有關[3～6]。90%的單純HPV 感染者可在2年內自然轉陰， 尤其是<30 歲女性。 從感染到宮頸癌變，一般要5～20年。

宮頸上皮的癌變過程包括許多基因和表觀基因的改變，DNA 甲基化是最常見的表觀遺傳學改變，常發生于腫瘤抑制基因的啟動子區域，造成該基因的轉錄失活，從而促使腫瘤的發生[7]。 本研究旨在探討宮頸癌基因甲基化檢測、高危型HPV 檢測對宮頸癌篩查的分流作用， 甲基化選取的是PAX-1 和SOX-1 基因。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2020年3月～12月間中日友好醫院宮頸病變診療中心門診就診的機會性篩查女性34例，年齡24～67 歲，平均41.5 歲；其中<35 歲人群占41.18%（14／34）。 34 例均有行陰道鏡檢查的指征， 患者同時進行了性傳播疾病（sexually transmitted disease，STD）十聯檢、高危型HPV17 分型檢測、甲基化檢測及組織病理學檢測。以組織病理學診斷為金標準，評價不同檢測方案的篩查效果。

1.2 實驗方法

1.2.1 STD 十聯檢測

STD 試劑盒（hybrid bio，中國），使用專門的宮頸分泌物取樣器，獲取宮頸細胞學樣本，采用導流雜交技術檢測宮頸細胞標本中10 種STI 病原體，包括淋球菌、沙眼衣原體、微小脲原體的1、3、6、14 型、人型支原體、生殖支原體、解脲脲原體和單純皰疹病毒Ⅱ型感染。

1.2.2 高危型HPV17 分型檢測

采用聚合酶鏈反應 （polymerase chain reaction，PCR）+導流雜交技術檢測宮頸細胞標本中17 種HPV 基因型感染， 包 含HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、 HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68，HPV82、 HPV6、HPV11，共17 種亞型。

1.2.3 甲基化檢測

DNA 分離和亞硫酸氫鹽處理根據制造商的建議，用DNA 迷你試劑盒（hybrid bio，中國）從收集到的宮頸脫落細胞樣本中提取基因組DNA。使用NanoDrop One／One c （Thermoscientific，Wilmington，美國）測定DNA 濃度。 DNA 產量為>200ng的樣品被考慮用于進一步的測試。 亞硫酸氫鹽處理純化基因組DNA 時， 根據制造商的建議使用DNA 甲基化試劑盒（hybrid bio，中國）。

DNA 甲基化測試利用ABI7500 PCR 系統（Life Technologies，Thermo Fischer Scientific， 美國）擴增taqman 為基礎的定量甲基化-特異性聚合酶鏈反應（QMSP），測定SOX1 和PAX1 的甲基化水平。 我們設計了Actin Beta 基因（ACTB）作為內參，并對每個標本進行了檢測。 如果標記ACTB的Ct 值≤35，則認為樣品具有足夠的質量。 總反應體積25μl：包含2μl modifified 模板DNA，23μl定制TaqMan 試劑。 PCR 在以下條件進行：95℃10min，95℃10s 45 個循環，60℃（根據引物集）20s。 如果甲基化SOX1 的Ct 值≤38.6，或者甲基化PAX1 的Ct 值≤38， 則認為整個DNA 甲基化試驗為陽性。

1.3 組織病理學診斷

組織病理學診斷標準依據WHO（2014）宮頸病變的分級系統[22]，所有樣本的組織病理學診斷均由2 名專業醫師獨立診斷分析。

1.4 統計學方法

應用SPSS22.0 軟件，計數資料采用率或百分比（%）進行統計描述，組間比較采用字2檢驗。

2 結果

STD 十聯檢測、甲基化檢測與高危型HPV 檢測對本組患者宮頸病變的診斷結果見表1。 表2示，三者聯合檢測均陽性的患者中87.5%（7/8）為組織病理學診斷高級別鱗狀上皮內病變 （high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）， 具有陰道鏡檢查指征的病例中有55.9%（19/34）為HSIL。

表1 3 種檢測結果與組織病理學診斷結果的比較n（%）

表2 STD 十聯檢、高危型HPV 檢測、甲基化檢測對宮頸病變篩查的分流

3 討論

3.1 宮頸病變的篩查方法

篩查宮頸癌前病變， 當前使用最廣泛的是液基細胞學和HPV 檢測，二者均有各自的優勢和局限性。 液基細胞學有較高的特異性但是敏感性較低，因為它受到取樣、制片、閱片等多方面因素影響，主觀依賴性強，對篩查人員的要求高，培養周期長， 且缺乏規范化的質量控制；HPV 檢測具有較高的敏感性， 但是它不能區分一過性感染和持續性感染，在性活躍的育齡女性中，檢出率較高，絕大多數的HPV 感染在幾年內可以自動清除，而這種一過性感染與宮頸癌的進展無關[23]。

高危型HPV 檢測在篩查子宮頸病變中，具有重要意義，高危型HPV（16/18 型）感染伴或不伴有細胞學異常、高危型HPV（非16/18 型）感染伴有細胞學異常、高危型HPV（非16/18 型）持續性感染伴或不伴有細胞學異常， 均是陰道鏡檢查的指征， 根據陰道鏡檢查病理結果判斷宮頸病變程度，并采取相應的治療措施，已成為宮頸病變診斷及治療指南的一部分。

宮頸上皮的癌變過程包括許多基因和表觀基因的改變，DNA 甲基化是最常見的表觀遺傳學改變，常發生于腫瘤抑制基因的啟動子區域，造成該基因的轉錄失活，從而促使腫瘤的發生[7]。

3.2 PAXl 基因和SOX-1 基因

國內外學者雖已對宮頸癌的多個基因異常甲基化進行了檢測，對DNA 甲基化與腫瘤發生發展的關系進行了研究和探討。 但同一基因在不同研究中存在較大差異，且大部分研究樣本量較少。本研究中甲基化選取的是PAX-1 和SOX-1。PAX-1基因隸屬于配對盒基因家族， 定位于染色體20p11， 是一種重要的轉錄調控因子，主要參與生骨節的分化， 在哺乳動物脊柱和胚胎細胞的增殖控制過程中發揮關鍵作用[8]。早在2008年，有研究發現[9]，PAX-1 基因在宮頸癌中因啟動子趨于甲基化而表達抑制失活， 經去甲基化處理后基因可重新表達，PAX-1 基因甲基化改變在宮頸上皮內瘤 變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）Ⅲ級及浸潤性宮頸癌患者的宮頸脫落細胞中被檢測到。 PAX-1 在宮頸癌組織中的甲基化頻率非常高，且隨病情的演變呈現明顯的上升趨勢。近年來多項研究發現[10～13]在浸潤性癌的鑒別中PAX-1 基因檢測的甲基化指數特異性更佳， 而在CINⅢ以上病變的篩查中特異度亦具有明顯的優勢。

SOX-1 為性別決定區域Y1，它定位于染色體13q34 上， 具有參與胚胎發育的調節以及決定細胞存亡的功能[14～16]。 既往有研究表明，SOX-1 基因在肺癌[17]、肝癌[18]、卵巢癌[19]、食管癌[20]等多種惡性腫瘤中甲基化水平增高， 在宮頸鱗癌組織和正常宮頸組織中存在差異表達， 其在腫瘤組織中甲基化水平異常升高， 而且其甲基化程度與宮頸上皮內瘤變分級相關。2016年的一項Meta 分析表明[21]SOX-1 基因甲基化在宮頸癌檢測中具有較高的敏感性， 可望成為一個潛在的宮頸癌篩查的分子標志物。

3.3 3種檢測聯合應用的優劣勢

由于在STD 檢測陽性病例中再進行HPV 分型檢測的陽性者需要進行陰道鏡檢測， 同時予以甲基化檢測后， 發現其陽性病例的組織病理學分級與陰道鏡活檢后的組織病理學分級結果高度吻合，考慮可對那些HPV 高危型陽性，且無陰道鏡活檢條件的患者進行分流。如不便隨診患者、依從性差的患者，預測其罹患HSIL 的風險，制定治療方案，不失為一種新的臨床評估手段，有望成為一項未來可期的替代篩查方案。

由于STD 十聯檢測、 甲基化檢測與高危型HPV 檢測這3 類檢測均可進行自動化操作，并可同時對大量的標本進行操作， 無需人工參與及單獨、繁瑣地檢測每份標本，從而大大降低了工作量和人工成本。進行三者聯合檢測，可以在短時間內獲得檢測結果， 本研究中三者同時陽性的患者中87.5%（7/8）組織病理學診斷為HSIL，但因存在漏診的可能性， 所以具有陰道鏡檢查指征的患者還是應盡可能行陰道鏡檢查。在今后的研究中，我們將繼續擴大檢測樣本量，以得到更佳的篩選方案。