基于腸道菌群的丹參-紅花藥對抗心肌缺血機制探討*

王小平，杜少兵，白吉慶，周慧慧，李 菁，權利娜，王鵬飛

（陜西中醫藥大學藥學院，陜西 咸陽 712046）

國家心血管病中心《中國心血管健康與疾病報告2019》指出，中國現有心血管疾病患者3.30 億，其中心肌梗死約250 萬，且患病率持續上升，而心肌缺血是導致心血管疾病患者死亡的主要原因［1］。丹參- 紅花屬活血化瘀藥對，療效確切，廣泛存在于具有活血化瘀功效的中成藥（如丹紅注射液、丹紅化瘀口服液、心寧片等）中［2］。腸道菌群與多種疾病密切相關［3-5］，推測丹參-紅花藥對抗心肌缺血可能與腸道菌群有關。為此，本研究中采用16S rRNA 基因測序技術，分析丹參-紅花藥對對急性心肌缺血模型大鼠腸道菌群豐度和不同分類水平的影響，探討該藥對抗心肌缺血的作用與腸道菌群調節的密切關系，為闡明其抗心肌缺血的機制奠定基礎，也為缺血性心臟病的防治提供有效的藥物治療靶點?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：RM2235 型切片機（徠卡顯微系統< 上海>有限公司）；QH01-9030A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；DP73 型顯微鏡（奧林巴斯<北京>銷售服務有限公司）；KQ-400KDE 型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；EXPERT 18K-R 型臺式高速冷凍離心機（長沙市鑫奧儀器儀表有限公司）；XSE105 型分析天平（瑞士梅特勒-托利多國際股份有限公司，精度為0.01 mg，0.1 mg）；Nano Drop NC2000型超微量分光光度計（美國ThermoFisher 公司）；BG-gds?AUTO（130）型凝膠成像系統（北京百晶生物技術有限公司）；DYY-6C 型瓊脂糖電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；2720 PCR型擴增儀（美國應用生物系統公司）；NovaSeq 測序儀（美國Illumina 公司）；FLX800T 型酶標儀（美國BioTek公司）。

試藥：鹽酸異丙腎上腺素（ISO，美國Sigma公司，批號為P1794259）；蘇木精（北京索萊寶科技有限公司，批號為H8070）；醇溶性伊紅Y（批號為A600190，生工生物工程<上海>股份有限公司）；天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（武漢默沙克生物技術有限公司，批號為kt22023）；肌酸激酶同工酶（CK）ELISA 試劑盒（上海邦奕商貿有限公司，批號為DRE20781）；大鼠CK - MB ELISA 試劑盒（上?？祈樕锟萍加邢薰?，批號為KS12296）；大鼠乳酸脫氫酶（LDH）ELISA 試劑盒（武漢默沙克生物科技有限公司，批號為kt30149）；大鼠心肌肌鈣蛋白I（cTnI）ELISA 試劑盒（美國Burlingame 公司，批號為kt30311）；瓊脂糖凝膠（批號為75510-019）、瓊脂糖凝膠電泳緩沖液（批號為AM9870）、NovaSeq 6000 SP 500 cycles Reagent Kit（批號為20012866）、Quant - iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（批號為P7589），均購自美國Invitrogen 公司；Marker（日本寶生物股份有限公司，批號為DL1500/DL2000）；Q5?High - Fidelity DNA 聚合酶（紐英倫生物技術<北京>有限公司，批號為M0491L）；MagPure Soil DNA LQ Kit（廣州美基生物科技有限公司，批號為D6356-03）；水為純凈水。丹參及紅花藥材均購自河北安國藥材市場，經陜西中醫藥大學白吉慶教授鑒定為真品。

動物：健康SPF級SD大鼠60只，雄性，體質量（200±20）g，購自成都達碩實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（川）2020 - 030。在溫度（25 ± 2）℃、相對濕度50% ± 10%條件下適應性飼養1 周，期間自由飲食。動物實驗通過陜西中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準號TCM-2018-030-E01）。

1.2 方法

1.2.1 丹參-紅花藥對有效物質的提取及質量控制

提取：取丹參飲片300 g，紅花飲片100 g，加8 倍量的水浸泡1 h，溫（45 ℃）浸2 h，取出，放冷至室溫，濾過，濾渣加8 倍量水，再提取2 次（每次2 h），濾過，濾液合并，減壓濃縮至250 mL（即相當于原藥材每1 mL含1.6 g）。實驗高、中、低劑量分別為1.6，0.8，0.4 g原藥材/mL。

質量控制：精密吸取含原藥材0.4 g / mL 的溶液6 mL，置10 mL容量瓶中，加水定容，采用高效液相色譜法測定。結果丹參素、原兒茶醛、羥基紅花黃色素A、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 的質量濃度分別為0.05，0.22，0.026，0.029，0.075，0.70 mg/ mL。

1.2.2 分組、給藥與復制模型

將60 只雄性SD 大鼠隨機分為空白對照組（A 組，等體積純凈水）、模型組（B 組，等體積純凈水）、復方丹參滴丸組（C組，73 mg/kg）及丹參-紅花低、中、高劑量組（D1組、D2組、D3組，相當于原藥材4，8，16 g/kg），各10只。各組大鼠灌胃給予相應純凈水或藥物，每天1次，連續7 d。于第6天、第7天灌胃1 h后，除A組外，其余各組大鼠皮下注射ISO（85 mg/ kg），選擇5 次心率計算ST 段偏移電壓的平均值，ST 段向上或向下偏移超過0.1 mV即為復制急性心肌缺血大鼠模型成功［6］。

1.2.3 藥效學指標檢測

心肌病理形態：采用HE 染色法。處死大鼠，取出心臟，固定，石蠟包埋、切片，脫蠟，以蘇木素染色。采用1%鹽酸酒精分化，以自來水返藍，伊紅染色，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察大鼠心肌病理形態。

心肌細胞凋亡情況：采用TUNEL 染色法。取出心臟，組織固定，石蠟包埋、切片，脫蠟，組織透化，過氧化氫封閉，酶標記，POD 標記，DAB 顯色，復染，封片，顯微鏡下觀察心肌細胞凋亡情況。

心肌酶：采用ELISA法。在末次注射ISO 12 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（5 mL/kg）麻醉［5］，腹主動脈取血，待凝固30 min 后常規離心，取血清。采用酶標儀檢測各孔吸光度（OD）值，計算大鼠血清中AST，CK，CKMB，LDH，cTnI活性或含量。

1.2.4 藥效綜合評分及效應評價

采用多指標綜合指數法［7］，對心肌細胞凋亡率、AST、LDH、CK、CK-MB、cTnI 6 個指標進行標化處理，計算丹參-紅花藥對抗心肌缺血的總效應值。當B組指標數值高于A 組時，V標化=（V模型-V給藥）/V模型；當B 組指標數值低于A 組時，V標化=（V給藥-V模型）/V模型，式中V為各指標數值。結合文獻報道和臨床實際檢測和衡量心肌缺血的指標，確定上述6 個指標的相對重要性，再利用變量投影重要性（VIP）定義各指標的權重，抗心肌缺血總效應值即為6 項指標標化值乘以權重后的總和。采用Simca軟件計算各指標的VIP值，依據VIP 值的大小判斷各個指標對總體結果的重要程度，通常VIP>1的指標貢獻較大。

將所有指標的數據導入Simca - P 11.5 軟件進行偏最小二乘判別分析（PLS-DS），通過對原始數據降維處理，建立包含第1 個主成分t［1］與第2 個主成分t［2］的PLS- DA 得分圖，得分圖的空間坐標就是各樣本在第1 個主成分和第2 個主成分構成的平面上的投影得分值，可直觀反映組間的相似或差異性，樣本的坐標點在得分圖上的位置越遠，說明樣本間的差異越明顯，反之亦然。根據組間樣本坐標點位置的遠近，獲取組間差異信息。結合綜合評分和PLS-DS 法的效應評價，從丹參-紅花高、中、低劑量組中選取療效最佳的一個組進行腸道菌多樣性分析。

1.2.5 腸道菌群多樣性分析

細菌DNA 抽提：以心臟HE 染色結果為依據，每組篩選3 只大鼠。取大鼠盲腸內容物200 mg，提取細菌總DNA，采用超微量分光光度計進行定量分析，以1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢查所提取DNA的完整程度。

DNA 文庫構建：PCR 上游引物為338F，序列為5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，下游引物為806R，序列為5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′。PCR 擴增條件，98 ℃預變性3 min；98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，28個循環；最終擴展延伸72 ℃5 min。以Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit 對PCR 擴增產物用酶標儀進行熒光定量分析。根據結果，按樣本測序量需求，按相應比例對樣本進行混合。

測序：通過Illumina Novaseq-PE250測序平臺進行2×250 bp 的雙端測序獲得的Paired-end（PE）reads，根據Fastq文件對測序樣品進行數據質量評估，根據PE reads之間的overlap（最小overlap 長度為10 bp）使用FLASH（http：// www. cbcb. umd. edu/ software/ flash，version 1.2.7）軟件拼接成1條序列，對目標序列進行質控過濾［采用fastx - toolkit 工具過濾數據，僅保留高質量（Q 值≥25）的堿基比例≥90%的reads］，過濾后的序列與參考數據庫（RDP）作比對，用usearch 64-bit 軟件進行嵌合體序列的檢測及過濾，去除已知序列的嵌合體，得到最終的優化序列?；趦灮蛄欣肬parse（http：// drive5. com/ uparse/ ，version 7.0.1090）進行OTU 聚類分析，基于OTU 聚類結果進行多樣性指數分析；基于Silva（如Release132，https：//www.arb- silva.de/docu?mentation/ release - 132）參考數據庫，對每個樣品的OTUs 進行物種分類學注釋，基于分類學信息進行物種結構分析和物種差異分析。

1.3 統計學處理

采用SPSS 22.0 統計學軟件分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心肌病理形態

A 組大鼠心肌形態結構正常，心肌細胞排列整齊，染色均勻，細胞核染清晰，偶見心肌間質散在炎性細胞。與A 組比較，B 組心肌間質疏松、充血、腫脹，伴有多量炎性細胞浸潤和紅細胞溢出，心肌纖維斷裂，心肌細胞核固縮、碎裂。與B 組比較，D3組和D2組，心肌形態結構基本正常，偶見心肌間質腫脹、充血，少量炎性細胞，紅細胞溢出；D1組，心肌間質腫脹、充血，伴有較多炎性細胞浸潤和紅細胞溢出，心肌細胞核固縮，心肌纖維斷裂。詳見圖1。

圖1 大鼠心肌病理形態（HE，×200）Fig.1 Myocardial pathomorphology of rats（HE，×200）

2.2 心肌細胞凋亡情況

詳見圖2。B組、C組及D1組、D2組、D3組大鼠心肌細胞凋亡率分別為26.2%，12.0%，3.2%，3.5%，8.4%。

圖2 大鼠心肌細胞凋亡情況（TUNEL，×400）Fig.2 Apoptosis of cardiomyocytes in rats（TUNEL，×400）

2.3 心肌酶水平

與A 組比較，B 組大鼠血漿LDH，CK，AST，CK -MB，cTnI 水平顯著升高（P<0.01）；與B 組比較，C 組及D1組、D2組、D3組大鼠血漿LDH，CK，AST，CK - MB，cTnI水平顯著降低（P<0.01或P<0.05）。詳見圖3。

2.4 藥效綜合評分

檢索到近10 年心肌缺血相關文獻報道1.6 萬篇，其中涉及心肌細胞凋亡，AST，LDH，CK，CK-MB，cTnI的數量分別為739篇、83篇、872篇、201篇、98篇、70篇；將所有指標的數據導入到SIMCA - P 11.5 軟件，可得到VIP 值（圖4）。可見，LDH、心肌細胞凋亡率、CK 指標的VIP 值均大于1，表明上述指標對心肌缺血的影響相對重要；而AST，CK-MB，cTnI 指標的VIP 值均小于1，表明其對心肌缺血的影響相對較小。再結合各指標標準化后的數據（見表1），最終確定心肌細胞凋亡、LDH 的權重系數為3，CK 的權重系數為2，AST，CK-MB，cTnI的權重系數為1。

表1 各組大鼠總抗心肌缺血效應值比較Tab.1 Comparison of total against - myocardial ischemia effect values of rats in each group

圖4 抗心肌缺血指標的VIP圖Fig.4 VIP diagrams of against-myocardial ischemia index

2.5 抗心肌缺血效應評價（PLS-DA 法）

A 組與B 組PLS - DA 得分有顯著差異，表明建模成功；A組、C組及D1組、D2組、D3組差異較小，但兩類之間有顯著差異，表明C 組及D2組、D3組大鼠急性心肌缺血狀態得到緩解；D2組、D3組部分重疊，表明差異較小。詳見圖5。

圖5 抗心肌缺血指標的PLS-DA得分圖Fig.5 PLS-DA scores of against-myocardial ischemia index

2.6 腸道菌群多樣性分析

Alpha 多樣性：指局部均勻生長環境下的物種在豐富度、多樣性和均勻度等方面的指標，其通過群落多樣性指數、群落均勻度指數與群落豐度指數等反映樣品的物種多樣性，以Chao1（Chao，1984）和Observed spe?cies 指數表征豐富度，以Shannon（Shannon，1948a，b）和Simpson（Simpson，1949）指數表征多樣性，以Pielou′s evenness（Pielou，1966）指數表征均勻度。與A組比較，B組Chao1，Observed species，Pielou，Shannon 和Simpson 指數顯著降低（P< 0.05，P< 0.01）。與B 組比較，D2組Chao1，Observed speciess，Pielou，Shannon 和Simpson 指數顯著升高（P<0.05，P<0.01），表明丹參-紅花藥對可有效增加盲腸中菌群豐度、菌群多樣性和均勻度。詳見表2。

表2 各組大鼠腸道（盲腸）菌群的α多樣性指數分析（±s，n=6）Tab.2 Analysis of α-diversity index of intestinal（cecal）bacte?ria of rats in each group（±s，n=6）

表2 各組大鼠腸道（盲腸）菌群的α多樣性指數分析（±s，n=6）Tab.2 Analysis of α-diversity index of intestinal（cecal）bacte?ria of rats in each group（±s，n=6）

組別A組B組D2組劑量（g/kg）0.73 8指數Chao1 3579.68±298.23 2394.88±249.74##3616.85±183.57**Observed species 3553.63±466.30 2376.78±228.21##3645.67±337.18**Pielou 0.82±0.05 0.72±0.07#0.80±0.03*Shannon 9.33±0.56 7.92±0.49##8.94±0.41**Simpson 0.92±0.01 0.84±0.02##0.99±0.01**

注：與A組比較：#P < 0.05，##P < 0.01；與B組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。表2，圖8，圖10、圖11同。a.AST b.LDH c.CK d.CK-MB e.cTnI圖3 大鼠心肌酶水平比較Note：Compared with those in group A，#P < 0.05，##P < 0.01；Compared with those in group B，*P < 0.05，**P < 0.01（for Fig.3，Tab.2，Fig.8，Fig.10-11）.a.AST b.LDH c.CK d.CK-MB e.cTnIFig.3 Comparison of myocardial enzyme levels of rats in each group

各組間菌群擴增子序列變異（ASVs）或可操作的分類單元（OTU）數量明顯發生改變。豐度等級曲線是分析多樣性的一種方式，以OTU 等級為橫坐標，以每個OTU中所含的序列數（log2）或者用OTU 中序列數的相對百分含量為縱坐標。該曲線用于解釋多樣性的物種豐度和物種均勻度2 個方面。在水平（橫軸）方向，物種的豐度由曲線的長度來反映，物種的豐度越高，曲線在橫軸上的范圍越大；曲線的形狀（平滑程度）反映了樣本中物種的均度，曲線越平緩，物種分布越均勻，曲線越陡峭，物種間的豐度差異越大。詳見圖6 A。D2組橫軸上的折線較長，表明其OTU 數量較多。詳見圖6 B。

Beta 多樣性：該分析用于評估微生物群落間的差異。與A 組比較，B 組菌群結構組成差異明顯，表明ISO誘導模型大鼠腸道菌群結構組成發生變化；而D2組偏離B 組，表明丹參-紅花藥對可改善ISO 模型大鼠腸道菌群結構組成和菌群多樣性。詳見圖6 C。

A.OTU數量 B. 豐度等級曲線 C.PCoA圖6 各組大鼠腸道（盲腸）菌群的OTU數量、豐度等級曲線、PCoA比較A.OTU amount B.Abundance grade curve C.PCoAFig.6 Comparison of OTU amount，abundance grade curve and PCoA of intestinal（cecal）bacteria of rats in each group

2.7 腸道菌群不同分類水平

門水平的腸道菌群組成：從各組樣品中鑒定出厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、軟壁菌門等16個菌門，厚壁菌門相對豐度最高，其次是擬桿菌門，厚壁菌門和擬桿菌門相對豐度的比值（F/B）可在一定程度上反映機體的健康狀態。詳見圖7。與A 組比較，B 組大鼠腸道菌群放線菌門、TM7 門的相對豐度和F/B 顯著降低（P<0.05），擬桿菌門、軟壁菌門、脫鐵桿菌門的相對豐度顯著升高（P< 0.01）；與B 組比較，D2組擬桿菌門、軟壁菌門和脫鐵桿菌門的相對豐度顯著降低（P<0.01），放線菌門、TM7門的相對豐度和F/B顯著升高（P<0.05），表明丹參-紅花藥對可調節失調的腸道菌群水平和菌群的組成，從而發揮抗心肌缺血作用。詳見圖8。

圖7 大鼠腸道菌群在門水平的類別及其相對豐度Fig.7 Classification and relative abundance of intestinal bacteria of rats in each group at phylum level

A. 擬桿菌門 B. 放線菌門 C. 軟壁菌門 D. 脫鐵桿菌門 E.TM7門 F. 厚壁菌門/擬桿菌門圖8 大鼠腸道菌群在門水平相對豐度顯著不同的菌門A.Bacteroidea B.Actinomycetes C.Tenericutes D.Deferribacteres E.TM7 F.Firmicutes/BacteroidetesFig.8 Phyla with significantly different relative abundances of intestinal bacterial at the phylum level of rats in each group

科、屬水平的腸道菌群組成：從3 組樣品中共得到腸道菌在科水平、門水平排名前17 位的科和屬水平組成，詳見圖9。與A 組比較，B 組大鼠腸道菌群中瘤胃菌科、擬桿菌科、理研菌科和艱難桿菌科相對豐度顯著升高（P< 0.01）；與B 組比較，D2組以上菌科相對豐度顯著降低（P<0.01）。詳見圖10。與A 組比較，B 組大鼠腸道菌群中顫螺菌屬和羅斯氏菌屬相對豐度顯著升高（P< 0.05），乳桿菌屬、棒狀桿菌屬、葡萄球菌屬和SMB53 屬相對豐度顯著降低（P< 0.05）；與B 組比較，D2組顫螺菌屬和羅斯氏菌屬相對豐度顯著降低（P<0.05），乳桿菌屬、棒狀桿菌屬、葡萄球菌屬和SMB53 菌屬相對豐度顯著升高（P<0.05）。表明丹參-紅花藥對可顯著調節急性心肌缺血模型大鼠腸道菌群。詳見圖11。

A. 科水平 B. 屬水平圖9 大鼠腸道菌群在科水平和屬水平的組成A.Family level B.Genus levelFig.9 Composition of intestinal bacteria of rats in each group at family level and genus level

A. 瘤胃菌科 B. 擬桿菌科 C. 理研菌科 D. 艱難桿菌科圖10 大鼠腸道菌群在科水平相對豐度顯著不同的菌科A.Ruminococcaceae B.Bacteroidaceae C.Rikenellaceae D.MogibacteriaceaeFig.10 Families with significantly different relative abundances of intestinal bacteria at the family level of rats in each group

A. 乳桿菌屬 B. 顫螺菌屬 C. 棒狀桿菌屬 D. 葡萄球菌屬 E. 羅斯氏菌屬 F.SMB53屬圖11 大鼠腸道菌群在屬水平相對豐度顯著不同的菌屬A.Lactobacillus B.Oscillosporia C.Corynebacterium D.Staphylococcus E.Rothia F.SMB53Fig.11 Genera with significantly different relative abundances of intestinal bacteria at the genus level of rats in each group

3 討論

本研究中以心肌病理、心肌細胞凋亡及心肌酶等指標，采用多指標綜合指數法，計算總效應值，評價高、厚壁菌門是腸道菌群的主要組成部分，其主要代謝產物為包括乙酸、丙酸和丁酸等在內的短鏈脂肪酸，而短中、低劑量丹參- 紅花藥對對模型大鼠心肌缺血的保護作用，結果可知，D3組>D2組>C組>D1組，由PLS-DA得分圖可知，D2組和D3組部分重疊，說明差異較小，故選取D2組進行腸道菌多樣性分析。結果表明，丹參-紅花藥對可顯著改善急性心肌缺血模型大鼠腸道中顫螺菌屬、羅斯氏菌、乳桿菌屬、棒狀桿菌屬、葡萄球菌屬和SMB53 菌屬的相對豐度，其抗心肌缺血作用可能是通過調節上述菌群實現的。

本研究結果表明，丹參- 紅花藥對可一定程度上調節門分類水平菌群，主要集中在厚壁菌門和擬桿菌門，顯著升高厚壁菌門的相對豐度和F/B（P< 0.01），鏈脂肪酸可誘導T 細胞分化成調節性T 細胞，保護心肌缺血［8］，說明丹參- 紅花藥對可能通過升高厚壁菌門的相對豐度和F/ B 改變腸道菌群的組成，促進T 細胞分化成調節性T 細胞而達到保護模型大鼠心肌缺血的目的。

在屬水平，心肌缺血模型大鼠的乳桿菌屬相對豐度水平顯著降低，羅斯氏菌屬相對豐度水平顯著升高，與已有文獻結論一致［9］。丹參- 紅花藥對能升高心肌缺血模型大鼠腸道中乳桿菌屬相對豐度、SMB53 菌屬、棒狀桿菌屬和葡萄球菌屬相對豐度，其中乳桿菌是維持腸道菌群平衡和健康的有益菌［10-13］，可改善心肌梗死后的心臟重塑［14］，還可通過谷氨酸脫羧合成γ- 氨基丁酸［15］，抑制促炎性細胞因子減輕炎性反應，起到心肌保護作用［16］。此外，乳桿菌等益生菌可上調心肌缺血模型大鼠神經遞質5 - 羥色胺和多巴胺的水平［17-18］，說明丹參-紅花藥對可能通過回調急性心肌缺血模型大鼠腸道益生菌的相對豐度來改善心肌缺血。

有研究表明，腸道菌群可通過參與色氨酸的代謝來影響CVD 的發生與發展［19］。大腸桿菌和乳桿菌等細菌中的色氨酸酶能將色氨酸轉化為吲哚和吲哚- 3 -乙酸（IAA）等，IAA 可減少炎性介質的產生，同時調節膽固醇和膽汁酸生物合成，減輕炎性反應［20］，而丹參-紅花藥對可升高急性心肌缺血模型大鼠腸道中乳桿菌屬相對豐度，說明丹參- 紅花藥對可能是通過升高乳桿菌屬的相對豐度，促進IAA的生成，減輕炎性反應，從而發揮保護心肌缺血的作用。

綜上所述，丹參- 紅花藥對的抗心肌缺血作用可能與調節性T 細胞分化增殖、色氨酸代謝途徑、抗炎作用有關，也可能與參與上述作用的相關菌群有關。本課題組后續將通過分子生物學方法對差異菌群和調節性T 細胞的分化增殖、色氨酸代謝途徑等可驗證途徑進行驗證。本研究有助于探討丹參- 紅花藥對抗心肌缺血的作用機制，為其臨床應用提供理論依據。