消癥化瘀灌腸液薄層色譜鑒別研究

劉鳳樂，羅悠悠，高文全，陳忻宇，王蕊蕊

（云南省大理白族自治州中醫醫院，云南 大理 671000）

消癥化瘀灌腸液由黃柏、黃芪、延胡索、丹參、川芎、甘草、當歸、敗醬草、魚腥草等10 余味藥材組方，黃柏為君藥，有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡等功效，黃芪、延胡索、丹參、當歸、敗醬草等為臣藥，可補氣行氣、活血化瘀、理氣止痛、排膿，配伍魚腥草、甘草等佐使藥，共奏活血化瘀、清熱利濕、理氣止痛功效，臨床主要用于治療急慢性盆腔炎癥［1］。薄層色譜（TLC）法因重復性好、對設備要求較低、方便易操作等特點常用于中藥復方制劑質量標準中定性鑒別研究。本研究中采用TLC法對制劑中黃柏、黃芪、丹參、延胡索、甘草5 味藥材進行了定性鑒別。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

PS - 30 型超聲波清洗儀（深圳市潔康洗凈電器有限公司）；SP - Ⅲ型薄層條帶點樣器（上海科哲生化科技有限公司）；DHG - 9030 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海齊欣科學儀器有限公司）；DV215CD 型電子分析天平（美國奧豪斯儀器有限公司）；HH-4型數顯恒溫水浴鍋（常州國華儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

丹參對照藥材（批號為120923 - 201615），黃柏對照藥材（批號為121510 - 201606），鹽酸小檗堿對照品（批號為110713-201613，含量為86.8%），延胡索對照藥材（批號為120928-201609），甘草對照藥材（批號為120904-202021），延胡索乙素對照品（批號為110726-201819，含量為99.8%），黃芪甲苷對照品（批號為110781-201606，含量為97.4%），黃芪對照藥材（批號為120974-201612），丹酚酸B對照品（批號為111562-201917，含量為96.6%），均購自中國食品藥品檢定研究院；薄層層析硅膠G 板（青島海洋化工廠、煙臺江友硅膠有限公司、浙江臺州生化塑料廠，規格為10 cm ×10 cm 或10 cm×20 cm）；消癥化瘀灌腸液（批號分別為20210301，20210302，20210303）及其陰性樣品均由醫院制劑室提供；其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別

黃柏［2-3］：取樣品2 mL，加甲醇20 mL，加稀鹽酸調pH至2，超聲（功率180 W，頻率40 kHz，下同）處理30 min，濾過，取續濾液濃縮至2 mL，即得供試品溶液。稱取鹽酸小檗堿對照品9.74 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得質量濃度為0.97 mg/mL的對照品溶液。稱取黃柏對照藥材粉末0.15 g，精密稱定，加甲醇20 mL 混勻，再加稀鹽酸調pH 至2，超聲30 min，濾過，濾液濃縮至2 mL，即得對照藥材溶液。取缺黃柏的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。參考2020年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC法，吸取上述供試品溶液、陰性對照品溶液各1.5 μL，對照品溶液、對照藥材溶液各1 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上以正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2，V/V/V）為展開劑，展距8 cm，展開，晾干后置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品溶液色譜與對照品溶液、對照藥材溶液色譜相應位置的熒光斑點顏色一致，陰性對照無干擾，詳見圖1 A。

延胡索［4］315，［5］：取樣品10 mL，加濃氨試液調至堿性，分別加乙醚30 mL 振搖提取3 次，合并提取液，蒸干，加甲醇1 mL 溶解殘渣，即得供試品溶液。稱取延胡索乙素對照品1.25 mg，精密稱定，置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成質量濃度為0.25 mg/mL 的對照品溶液。稱取延胡索對照藥材粉末1 g，精密稱定，加甲醇50 mL 溶解，超聲處理30 min，濾過，蒸干濾液，殘渣加水10 mL 使溶解，用濃氨試液調至堿性，分別加乙醚10 mL 振搖提取3 次，合并提取液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，即得對照藥材溶液。取缺延胡索的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。參考2020年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC法，吸取上述陰性對照品溶液、供試品溶液各10 μL，對照藥材溶液5 μL，對照品溶液2 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-丙酮（6∶1，V/V）為展開劑，預飽和30 min，展距11 cm，展開，取出，晾干后置碘缸中，約3 min后取出，揮盡板上吸附的碘，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品溶液色譜與對照品溶液及對照藥材溶液色譜相應位置的熒光斑點顏色一致，陰性對照無干擾，詳見圖1 B。

黃芪［4］315，［6］：取樣品5 mL，以水飽和的正丁醇振搖提取3 次，每次10 mL，合并正丁醇液，分別以15 mL 1% NaOH 溶液洗滌3 次，倒掉NaOH 液，正丁醇用水洗至中性，取正丁醇液，置水浴蒸干，加甲醇1 mL 溶解殘渣，即得供試品溶液。稱取黃芪甲苷對照品5.03 mg，精密稱定，置5 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得質量濃度為1.01 mg/mL 的對照品溶液。稱取黃芪對照藥材粉末2.25 g，精密稱定，加水30 mL使溶解，加熱回流1 h，濾過，取續濾液，濃縮至10 mL，分別以水飽和的正丁醇20 mL 振搖提取3 次，合并正丁醇，分別以1%NaOH 溶液15 mL 洗滌3 次，取正丁醇液，用水洗至中性，取正丁醇液，置水浴蒸干，再加甲醇1 mL 溶解殘渣，即得對照藥材溶液。取缺黃芪的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。參考2020年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC法試驗，吸取上述陰性對照品溶液、供試品溶液各10 μL，對照藥材溶液5 μL，對照品溶液2 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以氯仿- 甲醇- 水（13∶7∶2，V/V/V），靜置下層液為展開劑，預飽和30 min，展距10 cm，展開，晾干后噴10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱，待斑點顯色清晰停止。結果供試品溶液色譜與對照品溶液、對照藥材溶液色譜相應位置的斑點顏色一致，陰性對照無干擾，詳見圖1 C。

1-3. 供試品溶液 4. 對照藥材溶液 5. 對照品溶液6. 陰性對照品溶液A. 黃柏 B. 延胡索 C. 黃芪 D. 丹參 E. 甘草圖1 薄層色譜圖1-3.Test solution 4.Reference medicinal material solution 5.Refer?ence solution 6.Negative reference solutionA.Phellodendri Chinensis Cortex B.Corydalis Rhizoma C.Astragali Radix D.Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma E.Glycyrrhizae Radix et RhizomaFig.1 TLC chromatograms

丹參［4］79，［7］：取樣品10 mL，加稀鹽酸調pH 至2，再用乙酸乙酯振搖提取2 次，每次20 mL，取乙酸乙酯液，置水浴蒸干，加甲醇1 mL 溶解殘渣，即得供試品溶液。稱取丹酚酸B 對照品5.14 mg，精密稱定，置5 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成質量濃度為1.03 mg/mL的對照品溶液。稱取丹參對照藥材粉末0.2 g，加水25 mL使溶解，加熱回流1 h，濾過，取續濾液，用稀鹽酸調pH至2，分別以乙酸乙酯振搖提取2 次，取乙酸乙酯液，置水浴蒸干，加1 mL 甲醇溶解殘渣，即得對照藥材溶液。取缺丹參的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。參考2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC法，吸取上述陰性對照品溶液、供試品溶液各2 μL，對照品溶液5 μL，對照藥材溶液2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，氯仿-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（3∶2∶5∶0.5∶2，V/V/V/V/V）為展開劑，展距為11 cm，展開，晾干后噴以5%三氯化鐵顯色。結果供試品溶液色譜與對照品溶液、對照藥材溶液色譜相應位置的斑點顏色一致，陰性對照無干擾，詳見圖1 D。

甘草［8-9］：取樣品10 mL，分別以乙醚20 mL振搖提取3 次，收集提取溶液，蒸干，加1 mL 甲醇溶解殘渣，即得供試品溶液。取甘草對照藥材粉末1 g，加水50 mL 使溶解，加熱回流30 min，濾過，取續濾液，按供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。取缺甘草的陰性樣品，按供試品溶液制備方法，制備陰性對照品溶液。參考2020年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC法，吸取上述陰性對照品溶液、供試品溶液各15 μL，對照藥材溶液6 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯- 乙酸乙酯- 冰醋酸（14∶6∶0.5，V/V/V）為展開劑，展距12 cm，展開，取出，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果供試品溶液色譜與對照藥材溶液色譜相應位置的熒光斑點顏色一致，陰性對照無干擾，詳見圖1 E。

2.2 耐用性考察

黃柏：3個廠家薄層板展開時間跨度為36～133 min，分離度存在一定差異，但斑點行為一致，重復性好；條帶點樣和圓點點樣方式分離度均較好，斑點清晰；點樣量為1.5，3.0，5.0 μL 時，薄層展開行為一致，斑點分離度較好，清晰可辨。

延胡索：3個廠家薄層板展開時間跨度為14～45 min，分離度存在差異較小，斑點行為一致，重復性好；條帶點樣方式的斑點分離度均較好，圓點點樣方式斑點分離度稍差；點樣量為5，10，15 μL 時，展開行為一致，斑點分離度較好，5 μL點樣量斑點顏色較淡。

黃芪：3個廠家薄層板展開時間跨度為20～70 min，分離度存在差異較小，斑點行為一致，重復性好；條帶點樣方式的斑點分離度均較好，可清晰辨識，圓點點樣方式斑點顯色較慢、顏色較淡；點樣量為5，10，15 μL時，展開行為一致，斑點分離度較好，5 μL 點樣量斑點顏色較淡。

丹參：3個不同廠家的薄層板展開時間跨度為24～55 min，分離度差異較小，斑點行為一致，重復性好；條帶點樣和圓點點樣方式的斑點分離度均較好，可清晰辨識；點樣量為5，10，15 μL 時，展開行為一致，斑點分離度較好，不同體積點樣量斑點顏色稍有差異。

甘草：3個廠家薄層板展開時間跨度為35～55 min，重復性好；條帶點樣和圓點點樣方式的展開行為一致，圓點點樣方式分離度稍差；點樣量為5，10，15 μL 時，斑點分離度較好，斑點顏色稍有差異。

另選取黃柏、黃芪、丹參、延胡索、甘草5味藥材，分別在溫度5 ℃、相對濕度58%，以及溫度25 ℃、相對濕度45%條件下進行試驗，結果重復性、耐用性均較好。

3 討論

預試驗中對當歸- 川芎藥對［10］及敗醬草［11］等臣藥進行了研究，由于始終無法排除陰性干擾或因與對照藥材、對照品斑點不一致，無法列入質量標準草案。最終確定納入黃柏、黃芪、延胡索、丹參、甘草5 味藥材的TLC鑒別。

本研究中參考2020 年版《中國藥典》，并查閱了大量文獻，結合盡量少用或不用毒性較大試劑、樣品處理過程簡單等原則，分別對文中所選5味藥材的供試品溶液制備方法、展開條件、顯色方法等反復優化，并分別對不同的薄層板、溫濕度條件、點樣方式、點樣量、顯色方法等條件進行考察。其中甘草的預試驗中采用乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶2，V/V/V/V）為展開系統［12-13］，結果斑點均顯色，但位置不一致。最終采用甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸（14∶6∶0.5，V/V/V）為展開系統。結果各薄層板顯示主斑點清晰，分離度好，陰性對照無干擾。各藥材在相應薄層板展開時間跨度內斑點行為一致，重復性好，且在不同點樣方式和點樣量下的薄層展開行為一致，斑點分離度較好。

綜上所述，本研究中所建立的黃柏等5 味藥材TLC鑒別方法，耐用性、重復性等符合要求，能對消癥化瘀灌腸液所含藥味進行定性鑒別。