B型副雞禽桿菌田間分離株的毒力及免疫原性研究

王秀麗 ， 于 永 ， 于 雷 ， 李旭妮 ， 蔣玉文 ， 辛凌翔 ， 張 媛 ， 李俊平

(1.中國獸醫藥品監察所 ， 北京 海淀 100081 ； 2.南京農業大學 ， 江蘇 南京 210095 ; 3.北京中海生物科技有限公司 ， 北京 海淀 100081)

雞傳染性鼻炎(Infectious coryza,IC)是由副雞禽桿菌(Avibacteriunparagallinarun,Apg)感染引起的一種急性呼吸道疾病。該病是集約化養雞業重要的細菌病之一，主要是引起育成雞生長不良和產蛋雞產蛋率下降[1]，從而給養雞業帶來巨大的經濟損失。2018年8月—2019年9月期間，某大型白羽肉雞養殖場持續出現幼齡白羽肉雞感染副雞禽桿菌,發生傳染性鼻炎。本試驗從白羽肉雞場發病雞群病雞中分離并鑒定出B型副雞禽桿菌，對其毒力和免疫原性進行了測定，并將本菌對免疫了市場上銷售的雞傳染性鼻炎A型、B型、C型三價滅活疫苗和A型、C型二價滅活疫苗的雞群進行攻毒試驗，以期為雞傳染性鼻炎疫苗的生產和效力評價提供重要的物質基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種 副雞禽桿菌，分離自安徽省某白羽肉雞養殖場，經血清型檢定為B型，命名為AH-1株。

1.2 培養基及試劑 TSA、TSB培養基，均購自青島海博生物技術有限公司；雞血清、NAD，均購自北京奧博星生物技術有限責任公司；Tween-80、M52白油、司本，均購自北京益利藥品有限公司；雞傳染性鼻炎三價滅活疫苗，英特威國際有限公司生產；雞傳染性鼻炎三價滅活疫苗，印度尼西亞美迪安有限公司生產；雞傳染性鼻炎三價滅活疫苗，北京信得威特科技有限公司生產；雞傳染性鼻炎二價滅活疫苗(A型221株+C型H-18株)，天津瑞普生物技術股份有限公司。

1.3 實驗動物及雞胚 5～6胚齡SPF雞胚，35～40日齡SPF雞、65～70日齡SPF雞，均購自北京梅里亞維通實驗動物養殖公司。

1.4 毒力測定

1.4.1 攻毒菌液的培養及計數 將分離菌的凍存菌種劃線接種含10%雞血清和0.01%NAD的TSA瓊脂平板，倒置于5% CO2培養箱中37 ℃培養24 h，挑取單菌落接種100 mL含10%雞血清和0.01% NAD的TSB培養基中，37 ℃靜置培養16 h。同時，再挑取單菌落接種等體積的含10%雞血清和0.01% NAD的TSB培養基，同等條件靜置培養，參照前1天計數結果，稀釋菌液，測定毒力。

1.4.2 雞胚毒力測定 將新鮮培養的菌液用TSB培養基分別稀釋至5×102、1.5×103、3.0×103CFU/mL和4.5×103CFU/mL，每個濃度菌液經卵黃囊接種5～6胚齡SPF雞胚4只，同時取4只同等條件雞胚接種PBS作為對照，每只雞胚接種量均為0.2 mL，于孵化箱中繼續孵育，觀察雞胚的死亡情況。攻毒后對攻毒菌液進行活菌計數，確定實際攻毒劑量。

1.4.3 SPF雞毒力測定 將新鮮培養的菌液用TSB培養基分別稀釋至2.5×104、5.0×104、1.0×105CFU/mL和2.0×105CFU/mL，每個濃度菌液眶下竇接種35～40日齡SPF雞4只，同時取4只同等條件雞接種PBS作為對照，每只雞接種量均為0.2 mL，觀察7 d內雞發病情況。對攻毒菌液進行活菌計數，確定實際測毒劑量。

1.5 免疫原性測定

1.5.1 免疫原的制備 參照《中華人民共和國獸用生物制品規程》二○○○版[2]“雞傳染性鼻炎滅活疫苗”的制備方法制備免疫原，并參照其質量標準進行性狀、無菌檢驗和安全檢驗。

1.5.2 免疫原性測定 免疫程序：用35～40日齡SPF雞60只，AH-1抗原組免疫10只，A、B、C、D四個廠家疫苗各免疫10只，頸部皮下注射疫苗0.5 mL/只，另取10只分別頸部皮下注射0.5 mL PBS作為對照。最小發病劑量測定：按照1.4.2的方法測定分離菌對65～70日齡SPF雞的最小發病劑量。攻毒：免疫組和對照組在免疫28 d后，每只雞眶下竇內注射分離菌培養物0.2 mL(至少含1個最小發病劑量)，觀察7 d，記錄發病情況。

2 結果

2.1 攻毒菌液的培養 單菌落接種100 mL含10%雞血清和0.01% NAD的TSB培養基，靜置培養16 h活菌計數結果為1.0×109CFU/mL，估算同等條件培養的攻毒菌液活菌數為1.0×109CFU/mL。

2.2 毒力測定

2.2.1 雞胚毒力測定 將濃度為1.0×109CFU/mL的菌液先用TSB培養基稀釋105倍至濃度為1.0×104CFU/mL，后按表1稀釋至測毒劑量，測毒力。攻毒菌液活菌計數復數結果為1.1×109CFU/mL，實際測毒菌液濃度分別為5.5×102、1.6×103、3.3×103CFU/mL和5.0×103CFU/mL，雞胚攻擊110 CFU以上的菌液，30 h內均可死亡，最小致死劑量為110 CFU，死亡記錄見表2。

表1 攻毒菌液稀釋及測毒方法Table 1 Methods of dilution and toxicity testing of challenge bacterial solution for chicken embryos

表2 AH-1株對5～6胚齡雞胚毒力測定結果Table 2 Virulence test results of AH-1 stain in 5-6 days old chicken embryos

2.2.2 雞毒力測定 將濃度為1.0×109CFU/mL的菌液用TSB培養基稀釋103倍至濃度為1.0×106CFU/mL，然后按表3所示方法稀釋至測毒劑量，測毒力。攻毒菌液活菌計數復數結果為1.1×109CFU/mL，實際測毒菌液濃度為2.2×105、1.1×105、5.5×104CFU/mL和2.8×104CFU/mL。35～40日齡SPF雞攻擊5 500 CFU以上菌液，均可在48 h內出現腫頭、腫臉、流鼻涕等發病癥狀，在96 h以后癥狀逐漸減輕，至168 h后癥狀基本消失，最小發病劑量為5 500 CFU。發病記錄見表4。

表3 雞攻毒菌液稀釋及測毒方法Table 3 Methods of dilution and toxicity testing of challenge bacterial solution for chicken

表4 AH-1株對35～40日齡SPF雞毒力測定結果Table 4 Virulence test results of AH-1 stain in 35-40 days old SPF chicken

2.3 免疫原性測定

2.3.1 免疫原的檢驗 對制備的免疫原進行性狀、無菌檢驗和安全檢驗，結果顯示免疫原的劑型、穩定性和黏度均符合油乳劑滅活疫苗的規定。無菌檢驗顯示，在37 ℃ CO2培養箱培養的硫鹽(TG)和含有10%雞血清和0.01% NAD的TSA瓊脂斜面以及在25 ℃培養的TSB、TG和含有10%雞血清和0.01% NAD的TSA瓊脂斜面上均無菌生長，說明抗原未被污染，且滅活完全。安全性結果顯示，免疫原1.0 mL(免疫劑量的2倍)免疫35～40日齡SPF雞，14 d內免疫雞未出現任何因為注射引起的不良反應。

2.3.2 攻毒劑量的測定 65～70日齡SPF雞攻擊4 200 CFU以上菌液，4/4可在48 h內出現腫頭、腫臉、流鼻涕等發病癥狀，最小發病劑量為4 200 CFU，具體發病記錄見表5。

表5 AH-1株對65～70日齡SPF雞毒力測定結果Table 5 Virulence test results of AH-1 stain in 65-70 days old SPF chicken

35～40日齡SPF雞免疫30 d后，免疫組和對照組分別眶下竇內注射1 000 CFU AH-1株(含至少1個最小發病劑量)，免疫AH-1株制備抗原的雞10/10保護，免疫A商品雞傳染性鼻炎三價滅活疫苗的雞2/10保護，免疫B商品雞傳染性鼻炎A型、C型二價滅活疫苗的雞0/10保護，免疫C商品雞傳染性鼻炎三價滅活疫苗的雞3/10保護，免疫D商品雞傳染性鼻炎三價滅活疫苗2/10保護，對照雞10/10發病，說明AH-1株免疫原性良好，能抵抗本菌的攻擊，而市售的雞傳染性鼻炎三價滅活疫苗均不能完全抵抗本菌的攻擊，雞傳染性鼻炎A型、C型二價滅活疫苗完全無法抵抗B型菌的攻擊，說明A、C型副雞禽桿菌和本B型副雞禽桿菌之間無交叉保護(表6)。

表6 免疫保護試驗結果Table 6 Immune protection test results

3 討論

本試驗測定了從安徽省某肉雞場分離的1株副雞禽桿菌的毒力和免疫原性，同時還將本菌制備的抗原與目前國內外市場上銷售的雞傳染性鼻炎三價或者二價滅活疫苗免疫效力進行比較。毒力試驗結果顯示，本菌對5～6胚齡雞胚及35～40日齡SPF雞均有較強的致病力，毒株對雞胚的最小致死劑量為110 CFU，對SPF雞的最小發病劑量為5 500 CFU，而雞傳染性鼻炎滅活疫苗的生產檢驗用毒株Hpg-8(A型)和Hpg-668(C型)最小致死劑量約為300 CFU，對SFP雞的最小發病劑量均為7.5×104CFU，有40%左右的雞發病癥狀不典型，以106CFU BJ-05株(B型)感染SPF雞，仍有2/5的雞只未發病，說明本菌株的毒力較目前國內的疫苗株毒力均強[2-3]。免疫原性試驗結果顯示，本菌免疫原性良好，而市場上銷售的3個雞傳染性鼻炎三價滅活疫苗均無法完全抵抗本菌的攻擊，雞傳染性鼻炎A型、C型二價滅活疫苗完全不保護，顯示分離菌和疫苗毒株之間的抗原性存在差異，本菌制備的免疫原對目前雞傳染性鼻炎三價苗的B型強度株和流行的B型野毒株是否具有保護力，有待進一步研究。

副雞禽桿菌的致病性和保護性抗原均與多種因素有關，其中HA抗原是研究者們最關注的[4-6]，HA抗原、莢膜多糖、金屬蛋白酶等均與毒力相關[7-8]，有文獻報道副雞禽桿菌中提取的HA抗原具有保護性，但疫苗免疫后不刺激產生HI抗體同樣具有保護性[9]，說明其他抗體在免疫保護過程中也產生重要作用。

目前認識的9種副雞禽桿菌的Kume血清型分別為A型(A1、A2、A3、A4)、B1型、C型(C1、C2、C3、C4)，且9個不同血清型參考菌株之間的交叉保護試驗已經完成，充分證明了A型、B型、C型血清群之間的免疫關系相距較遠。也有證據顯示，在Page血清型B血清群內只有部分交叉保護[9]。

本試驗再次證明雞傳染性鼻炎滅活疫苗只能提供含有血清型的保護，而B型菌不同菌株之間只能提供部分交叉保護。龔玉梅等對我國雞傳染性鼻炎流行態勢分析顯示，我國2012—2017年雞傳染

性鼻炎以B型株為主，而2019年其流行情況發生變化[10-11]。冀笑明等2019年流行病學調查結果顯示，B型副雞禽桿菌仍大面積流行且占主導地位[12]。近幾年，我國免疫疫苗的祖代種雞、蛋雞、肉雞養殖場雞傳染性鼻炎在全國范圍內頻發，推測疫苗毒株與流行毒株之間抗原性存在差異是免疫失敗的重要原因。因此，研制含有多個B型分離株的疫苗或篩選免疫原性好，交叉保護效果好的毒株是預防和控制本病流行的重要方向。