基于網絡藥理學探究芪姜粉治療豬脾胃虛寒型腹瀉的效果和作用機制

呂建雨 ， 張岳峰 ， 彭海馨 ， 王匯鑫 ， 李艷華

(東北農業大學動物醫學學院 ， 黑龍江 哈爾濱 150030)

根據中醫理論，黃芪性微溫、味甘，有利水消腫、退腫生肌的功效，《名醫別錄》、《本草綱目》等中醫學著作均認為其有補中益氣的作用，藥用歷史悠久。黃芪在臨床上對于治療腹瀉有著很好的療效[1]，在生產養殖中，常常被加入到斷奶豬日糧中使豬腹瀉率顯著降低[2]。生姜性溫，是重要的藥食同源藥材，有祛風發汗、溫中散寒的功效。黃芪搭配生姜對脾胃虛寒型腹瀉有一定治療作用。

腹瀉作為豬群的一種常見癥狀，是指排便次數增多，明顯超過平時頻率，糞質稀薄，水分增加，伴有腹痛、排便急迫感、里重后急、失禁等癥狀。各個年齡段的豬均能患病，仔豬的發病率與死亡率最高，嚴重影響我國養豬業的快速發展，給我國養豬業帶來了巨大損失。腹瀉屬中醫“泄瀉”范疇，脾虛是其發病的主要病機之一。傳統中醫理論認為，腹瀉主要由于濕盛與脾胃功能失調所致。脾主運化、升清，胃主受納、腐熟水谷。脾虛則升清運化失職，胃弱則受納腐熟力衰，久及于腎，腎陽不足，則固攝失權，終導致腸道不固，清濁不分，而病泄瀉[3]。治療上以益氣、健脾為主，有其他兼證則辨證用藥[4]。黃芪有健脾益氣的功效，生姜不僅可以健脾，還可抗菌、驅寒，兩者配伍使用可補氣健脾，溫中散寒。由于傳統中藥復方具有多途徑、多成分、多靶點的特點，通過現代醫學很難闡明芪姜粉治療脾胃虛寒型腹瀉的作用機制。在系統生物學、多向藥理學、計算生物學等多學科技術快速發展的基礎上，從整體、系統角度研究藥物機制的網絡藥理學是近10年提出的藥物研發新方法，與中藥復方基本特點相吻合[5]。本試驗基于網絡藥理學的理論，運用網絡藥理學方法通過構建核心成分—靶點—通路網絡，從整體、系統的角度上分析芪姜粉治療豬脾胃虛寒型腹瀉的效果和作用機制，為下一步的深入探究提供參考。

1 材料與方法

1.1 芪姜粉活性成分的篩選 利用中藥系統藥理學分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP,http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)檢索黃芪和生姜的有效成分，各單味藥的活性成分口服利用度(OB)和類藥性(DL)篩選閾值分別設置為OB≥30，DL≥0.18[6]。并收集對應靶點，將篩選出來的芪姜粉的活性成分信息在Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org)進行校正，檢索條件設置為“Organism:Susscrofa”，獲取活性成分和其對應的靶點。

1.2 芪姜粉—活性成分—靶點網絡圖的構建 整理從Uniprot數據庫獲取的活性成分和靶點，利用Cytoscape 3.7.2軟件構建芪姜粉—活性成分—靶點網絡圖，分析活性成分和靶點之間的度(Degree)值。

1.3 芪姜粉—腹瀉韋恩圖的構建 以腹瀉(Diarrhea)為關鍵詞在GeneCards數據庫與OMIM數據庫中檢索與腹瀉相關的基因，通過Uniprot數據庫進行校正，物種選擇為豬(Susscrofa)，利用Venny 2.1.0在線作圖工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)獲得芪姜粉—腹瀉共有靶點的韋恩圖。

1.4 芪姜粉—成分—腹瀉—靶點網絡圖的構建 整理交集靶點和對應的活性化合物，利用Cytoscape 3.7.2軟件構建芪姜粉—活性成分—腹瀉—靶點網絡圖。

1.5 蛋白質相互作用網絡圖的構建 將交集靶點上傳至String數據庫(https://string-db.org)，物種選擇為豬(Susscrofa)，置信度高于0.7，并隱藏游離節點，導出蛋白相互作用(PPI)網絡圖及互作關系表。利用Cytoscape 3.7.2對互作關系表中蛋白連接關系進行分析，根據Degree值篩選核心基因并通過Excel繪制柱狀圖進行可視化。

1.6 基因本體(GO)功能富集注釋分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 將交集基因上傳至DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov)數據庫，設置物種(Species)為“Susscrofa(豬)”、背景(Background)為“Susscrofa”、標識符(Identifier)為“Official gene symbol (官方名稱)”，進行 GO功能注釋和KEGG富集分析。篩選P<0.05的富集條目，并根據P值降序排序，選擇排名前20位的條目通過在線作圖平臺——微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)進行富集分析結果的可視化。

2 結果

2.1 芪姜粉—活性成分—靶點網絡圖的構建 在TCMSP分別輸入芪姜粉中的2種藥物：黃芪和生姜，一共可以得到352個活性成分。分別設置OB≥30，DL≥0.18，得到25個活性成分(黃芪20個，生姜5個)，剔除沒有相關靶點的活性成分并通過Uniprot數據庫校正，可篩選出20個活性成分(黃芪16個，生姜4個)，并對篩選出來的活性成分進行編號。各活性成分詳細信息見表1。利用這20個活性成分和對應靶點的關系，通過Cytoscape 3.7.2軟件構建“芪姜粉—活性成分—靶點”網絡圖，結果見圖1。

表1 芪姜粉潛在活性成分Table 1 Potential active components of Qijiang powder

藥物—活性成分—靶點網絡圖分析：圖1中共包含181個節點和399條邊，其中包括20個活性成分節點、159個靶基因節點和2個中藥節點。利用“cytoHubba”插件對網絡圖進行拓撲分析，并根據“Degree(度)”值進行排序，Degree值越高代表活性成分或靶點在互作網絡越重要，拓撲分析結果表明，排名前10位的活性成分分別為槲皮素(Quercetin)、山奈酚(Kaempferol)、7-O-甲基異丙醇胺(7-O-methylisomucronulatol)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、刺芒柄花素(Formononetin)、豆甾醇(Stigmasterol)、異鼠李素(Isorhamnetin)、3,9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚(3,9-di-O-methylnissolin)、美迪紫檀素[(6aR,11aR)-9,10-dimethoxy-6a,11a-dihydro-6H-benzofurano[3,2-c]chromen-3-ol]、毛蕊異黃酮(Calycosin)，各活性成分詳細信息見表2。

表2 芪姜粉—活性成分—靶點網絡中排名前10位的活性化合物信息Table 2 Information on the top 10 active components in the Qijiang powder—active components—target network

圖1 芪姜粉—活性成分—靶點網絡Fig.1 Drug—active components—target network of Qijiang powder藍色菱形：靶基因； 紫色和黃色圓形：分別為黃芪、生姜的活性成分； 紅色正六邊形：黃芪； 綠色正六邊形：生姜；節點大小與Degree值成正比Blue diamonds: Target genes; Purple and yellow circles: Active components of Astragalus membranaceus and ginger respectively; Red regular hexagon: Astragalus membranaceus; Green hexagonal:Ginger. The node size was proportional to the degree value

排名前10位的靶點分別為前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2)、核受體共激活因子2(NCOA2)、前列腺素內過氧化物合酶1(PTGS1)、鈣調蛋白1(CALM1)、視網膜酸受體(RXRA)、過氧化物酶體增生激活受體γ(PPARG)、誘導型一氧化氮合酶(NOS2)、γ-氨基丁酸A受體α1(GABRA1)、Beta-2腎上腺素受體(ADRB2)和黃體酮受體(PGR)，具體結果見表3。

表3 芪姜粉—活性成分—靶點網絡中排名前10位的靶點信息Table 3 Information on the top 10 targets in the Qijiang powder—active components—target network

2.2 芪姜粉化合物與疾病靶點交集Venn圖的構建 從GeneCards數據庫與OMIM數據庫中共檢索到5 403個腹瀉相關靶點，將疾病靶點和藥物成分靶點取交集，最終得到130個關鍵靶點。通過Venny 2.1.0在線作圖工具繪制出芪姜粉—腹瀉共有靶點的韋恩圖，結果見圖2。

圖2 芪姜粉—腹瀉共有靶點的韋恩圖Fig.2 Venn diagram of mutual target of Qijiang powder—diarrhea

2.3 芪姜粉—活性成分—腹瀉—靶點網絡圖的構建 利用Cytoscape 3.7.2軟件構建芪姜粉—活性成分—腹瀉—靶點網絡圖，結果如圖3所示。在網絡圖中包括153個節點和470條邊，其中腹瀉節點1個、藥物節點2個、活性成分節點20個以及靶蛋白節點130個。由圖3可知，藥物、活性成分、腹瀉與關鍵靶點之間的關系錯綜復雜，1種有效成分可以作用于多個靶點，1個靶點也與多個有效成分相互作用，符合中藥復方多途徑、多成分、多靶點共同作用的基本特點，但是單以“Degree”值的大小去判斷活性成分或靶點在治療腹瀉的生物進程中是否重要過于片面，需要繼續深入探究。

圖3 芪姜粉活性成分—腹瀉—靶點網絡圖Fig.3 Active components—diarrhea—target network map of Qijiang powder藍綠色圓形節點:豬腹瀉相關靶點； 紫色菱形節點:化合物與豬腹瀉共同靶點； 棕色和綠色正八邊形節點:分別為黃芪、生姜的活性成分；節點大小與Degree值成正比Blue-green circular nodes:Porcine diarrhea related targets; Purple diamond node:Common target of compound and porcine diarrhea; Brown and green octagonal nodes:Active components of Astragalus membranaceus and ginger respectively. The node size was proportional to the degree value

2.4 芪姜粉在豬體內蛋白相互作用(PPI)網絡圖的構建 利用String數據庫構建蛋白相互作用(PPI)網絡圖，物種選擇為“Susscrofa”，打分值設置高于0.7最高置信度，PPI網絡圖見圖4。將得到的數據進行整理排序，并將圖中關鍵靶點度可視化，如圖5。其中TNF、TP53、IL-8、IL-6等靶點排名靠前，推測可能在芪姜粉治療豬腹瀉的生物進程中發揮較重要的作用。

圖4 芪姜粉—豬腹瀉靶點PPI網絡圖Fig.4 PPI network diagram of Qijiang powder—porcine diarrheal targets

圖5 芪姜粉抗腹瀉核心靶點柱狀圖Fig.5 Anti-diarrhea targets centered networks of Qijiang powder

2.5 芪姜粉治療豬腹瀉GO功能富集注釋分析及KEGG通路富集分析 將芪姜粉—豬腹瀉PPI網絡圖中的靶點基因上傳于DAVID數據庫，物種選擇為“Susscrofa”，將得到的數據進行篩選后(P<0.05)，共得到GO注釋分析條目272個，其中生物過程(Biological process)條目198個、分子功能(Molecular function)條目23個、細胞組成(Cellular component)條目51個，將所得GO注釋分析條目根據P值進行降序排序，分別取各組前10位繪制柱狀圖。由圖6可知，生物過程主要涉及RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控(Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、脂多糖介導的信號通路(Lipopolysaccharide-mediated signaling pathway)和腺酸酯環酶激活腎上腺素受體信號通路(Adenylate cyclase-activating adrenergic receptor signaling pathway)過程比較靠前；分子功能主要涉及細胞外間隙(Extracellular space)、細胞核(Nuclear)、細胞外基質(Extracellular matrix)等；細胞組成主要涉及序列特異性DNA綁定轉錄因子(Transcription factor activity,sequence-specific DNA binding)、相同的蛋白質結合(Identical protein binding)、細胞因子活性(Cytokine activity)等。

圖6 芪姜粉—豬腹瀉GO富集分析Fig.6 GO enrichment analysis of Qijiang powder—porcine diarrhea

對KEGG通路進行篩選(P<0.05)，可得到119條通路，按降序排列，將前20條通路可視化為氣泡圖，結果見圖7。圖中氣泡的大小代表該通路富集到的靶點數量，氣泡顏色的深淺代表蛋白富集程度的高低。由圖7可知，主要富集條目包括癌癥中通路(Pathways in cancer)、乙型肝炎(Hepatitis B)、美洲錐蟲病[Chagas disease(American trypanosomiasis)]等。

圖7 芪姜粉—豬腹瀉KEGG通路富集分析Fig.7 KEGG pathology enrichment analysis of Qijiang powder—porcine diarrhea

3 討論

傳統中醫理論認為，腹瀉隸屬于“泄瀉”范疇，疾病日久不愈，加之失治誤治，患者常表現為脾胃虛寒證[7]。脾胃虛寒型是一種中醫證型，主要是指脾胃陽氣虛衰，陰寒內盛所表現的證候，常有納呆腹脹、脘腹痛、四肢不溫、大便稀溏、小便清長或不利等癥狀表現[8]。現代醫學理論認為，腹瀉的發病機制常常涉及炎癥、水和電解質失衡、胃腸激素分泌、腸黏膜損傷等因素[9]。此外，多種腫瘤也可誘發腹瀉，腹瀉是腫瘤的一種常見臨床癥狀，腫瘤相關性腹瀉多為伴隨癥狀，但也有以腹瀉為首發或突出表現[10]。

網絡藥理學是系統生物學的重要組成部分，其整體性、系統性和注重藥物間相互作用的特點與中醫藥學的基本特點相吻合。網絡藥理學提供了一種新型的研究方法，通過大數據的分析，將傳統中藥研究和現代藥理學聯系在一起，多方面、深層次、系統性的挖掘藥物與機體之間的關系，得到越來越多學者的認可，顯著加快中藥現代化、國際化的進程[11]。本試驗主要通過對芪姜粉—活性成分—靶點網絡、芪姜粉—活性成分—腹瀉—靶點網絡圖中拓撲學參數的計算和蛋白相互作用(PPI)網絡圖等進一步揭示關鍵作用靶點、藥效物質基礎通路、活性成分和通路。

通過網絡藥理學分析預測芪姜粉中發揮抗腹瀉作用的藥效物質基礎可能是槲皮素、山奈酚、7-O-甲基異丙醇胺、β-谷甾醇等。槲皮素可以通過抑制小鼠小腸推進，減慢小腸蠕動作用，來對腹瀉產生抑制作用[12]。山奈酚作為一種常見的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤的作用[13]。廖美華等[14]發現，山奈酚是參苓白術散治療腹瀉型腸易激綜合征(IBS-D)的最核心化合物之一，在干預IBS-D過程中起到重要的調控作用。根據現有文獻，未檢索到7-O-甲基異丙醇胺的有關報道，其藥理作用有待進一步研究。β-谷甾醇具有抗腫瘤[15]、抗炎[16]和降低胃黏膜損傷[17]的作用。研究表明，β-谷甾醇對于枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等胃腸道常見菌群均有較好的抑制作用[18]。馮思敏等[19]發現，β-谷甾醇通過抑制IL-6和COX-2的表達來改善葡聚糖酸鈉誘導的小鼠結腸炎，抑制腹瀉、體重下降、便血、結腸縮短、結腸組織形態破壞等典型的急性腸炎病癥。綜上可知，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇可能通過抑制炎癥發生、調節細胞凋亡來治療腹瀉。研究發現，3種活性成分均有保護、修復損傷細胞的功能[20-22]，對治療腹瀉也有一定的幫助。

通過對活性成分—靶點網絡圖進行分析，其中可能發揮關鍵作用的靶點有前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2)、核受體共激活因子2(NCOA2)、前列腺素內過氧化物合酶1(PTGS1)、鈣調蛋白1(CALM1)等。PTGS1和PTGS2是PTGS的2種同工酶，其中PTGS1為結構型，主要參與調節正常組織細胞的多種生理活動[23]；PTGS2為誘導型，通常介導炎癥反應[24]以及調控腫瘤的生成和發育[25-28]。臨床試驗表明，PTGS2可以通過調節凋亡抑制基因(Bcl-2)的表達[25]，對腫瘤產生抑制作用，PTGS2抑制劑也將成為抗腫瘤治療的新方法。NCOA2在生物體內涉及發育、內分泌調節和腫瘤發生等反應[27]，NCOA2是乳腺癌治療的潛在靶點，使MAPK/ERK信號級聯的管制下降，調控NCOA2的下游目標RASEF，顯著抑制不同乳腺癌細胞系的細胞增殖。CALM是細胞內Ca2+的主要受體，參與細胞生長和代謝，在細胞分裂增殖和腫瘤的侵襲、轉移中起重要作用[28]。CALM1與骨關節炎的發生也有一定的聯系[29]。綜合上述可知，這些靶點的功能多集中于炎癥及細胞凋亡方面，正好切入腹瀉的發病機制，其相關聯的蛋白以及信號通路調節則需要進一步分析。

通過對蛋白相互作用(PPI)網絡圖進行分析，共篩選出核心靶點20個，其中腫瘤壞死因子(TNF)、細胞腫瘤抗原基因(TP53)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)相關性較高，推測可能在治療豬腹瀉中發揮較重要的作用。TNF是一種常見的促炎因子，可誘發炎癥因子的釋放，加重機體的炎癥反應[30]，并且對腫瘤具有直接殺傷或抑制增殖的作用[31]。TP53 是一種廣譜腫瘤抑制基因，其產物為多功能的轉錄調節因子，可以發揮調節細胞生長、細胞凋亡和 DNA 修復的作用[32]。IL-6是由單核-巨噬細胞等分泌的促炎性細胞因子，對調節組織損傷、免疫反應和腫瘤生長、轉移方面有重要意義[33]。IL-6可以通過損壞腸黏膜屏障功能，使炎性滲出增加，從而引起腹瀉[34]。臨床試驗表明，通過降低炎癥因子TNF-α和IL-6 的水平，可以減輕大腸埃希菌感染的哺乳期小型豬的腹瀉程度[35]。IL-8是一種強而有力的中性粒細胞趨化因子和活化因子，在炎癥反應中起更直接的介導作用。張珺等[36]認為，血清中IL-8、TNF-α水平可作為反映潰瘍性結腸炎病變程度和判斷預后的一個客觀指標。有研究表明，IL-8可通過腫瘤及腫瘤血管內皮細胞表面的受體，直接或間接促進腫瘤細胞的增生、新生血管的形成，從而促進腫瘤的生長和轉移[37]。由此推測，芪姜粉治療腹瀉可能是通過TNF、TP53、IL-6和IL-8等關鍵靶點抑制機體的炎癥反應及調控細胞凋亡來發揮作用。

由KEGG信號通路的富集分析氣泡圖可知，涉及與癌癥相關的通路較多，因此推測槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等活性成分與癌癥的發生有很大關系，與藥物活性成分聯系較密切的關鍵靶點，例如PTGS2、NCOA2、PTGS1、CALM1等，均涉及生物體內癌癥的發生發展與細胞凋亡的調控。由此推測，芪姜粉可能通過PTGS2、NCOA2、PTGS1、CALM1等靶點發揮抗癌作用。

綜上所述，芪姜粉以槲皮素、山奈酚、7-O-甲基異丙醇胺、β-谷甾醇等藥效物質基礎調控PTGS2、NCOA2、PTGS1、CALM1等癌癥通路的多個靶點，通過抗炎、調控細胞凋亡和保護損傷細胞的機制，發揮抗腹瀉的作用，體現了中藥多成分、多靶點和整體發揮作用的特點，為進一步深入揭示芪姜粉治療腹瀉的藥理機制提供了科學依據。但是預測結果可能與實際存在偏差，需要進行體外試驗深入探究，闡明其具體作用機制。