正常和腹瀉水貂腸道微生物16S rRNA測序差異性分析

任建煒 ， 徐 航 ， 莊桂玉 ， 溫建新

(1.青島農業大學動物醫學院 ， 山東 青島 266109 ； 2.青島西海岸新區農村農業局 ， 山東 青島 266400)

引起水貂腹瀉的因素有很多，常存在混合感染致病的情況，主要分為病原性腹瀉和非病原性腹瀉，其中病原性腹瀉包括病毒性腹瀉、細菌性腹瀉和寄生蟲性腹瀉等[1]。腹瀉的發生沒有明顯的季節性，溫度、飲食、用藥及免疫等很多方面都能引起水貂腹瀉，養殖戶在確診前的用藥對疾病的控制有重要影響[2]，如不清楚病因時盲目用藥，可能會加重病情，因此需要對腹瀉的原因進行準確的鑒定和診斷[3]，如采用腸桿菌基因間重復共有序列PCR(Enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR,ERIC-PCR)技術可以分析出毛皮動物腸道內的益生菌和有害菌菌種[4]。在各種因素的作用下，不同個體腸道內正常菌群的種類、數量和分布是不固定的、變化的[5]。因抗藥、耐藥性的細菌不斷產生，以及超級細菌的出現，使毛皮動物腸道疾病多發，且多出現混合感染的情況[6]。本試驗將對青島西海岸某水貂養殖場中的腹瀉水貂和正常水貂的糞便進行16S rRNA測序，并通過分類操作單元(Operational taxonomic units,OTU)分析對正常水貂和腹瀉水貂糞便中菌群的物種分布和物種豐度聚類進行分析，從而得出腹瀉水貂與正常水貂腸道微生物的物種分布、結構以及物種豐度聚類的差異,可以準確得出腹瀉水貂腸道內菌群的分布、種類和豐度，對腹瀉進行進一步診斷，并采取措施使機體體內微生態環境恢復正常狀態，達到治療腹瀉的目的。

1 材料與方法

1.1 材料 于青島西海岸新區某水貂養殖場隨機采集同一養殖場、同一時間正常水貂和腹瀉水貂糞便。

1.2 方法 將隨機采集的糞便進行樣本合并后稀釋并進行分組，每組3個重復，分別為正常組(NM-1、NM-3、NM-5)和腹瀉組(DM-1、DM-3、DM-4)。所有樣品送至安諾優達基因科技(北京)有限公司進行測序，對測序結果進行分析。

2 結果

2.1 物種分布

2.1.1 門水平分布 6個樣品共得到2個門，分別為厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)，見表1。腹瀉組中厚壁菌門分別占比83.00%、58.00%和88.00%，高于正常組，差異顯著(P<0.05)；腹瀉組中變形菌門分別占比17.00%、42.00%和12.00%，低于正常組，差異顯著(P<0.05)。與正常組腸道菌群相比，腹瀉組的優勢菌群是厚壁菌門，正常組中的優勢菌群是變形菌門。

2.1.2 綱水平分布 6個樣品共得到3個綱，分別為芽孢桿菌綱(Bacilli)、梭菌綱 (Clostridia)和丙型變形菌綱(Gamma proteobacteria)，見表1。腹瀉組中芽孢桿菌綱分別占比12.00%、1.50%和13.20%，與正常組相比差異不顯著(P>0.05)；梭菌綱僅在腹瀉組中檢測出，分別占比 60.00%、58.50%和74.80%，明顯高于正常組，差異極顯著(P<0.01)；腹瀉組中丙型變形菌綱分別占比28.00%、40.00%和12.00%，低于正常組，差異顯著(P<0.05)。與正常組腸道菌群相比，腹瀉組優勢菌群是梭菌綱，正常組優勢菌群是丙型變形菌綱。

表1 細菌門水平和綱水平分布分析Table 1 Analysis of the distribution of bacterial phylum and class level (%)

2.1.3 目水平分布 6個樣品共得到5個目，其中比例較高的4個目分別為乳桿菌目(Lactobacillales)、梭菌目(Clostridiales)、巴氏桿菌目(Pasteurellales)和腸桿菌目(Enterobacteriales)，見表2。梭菌目和巴氏桿菌目僅在腹瀉組中檢測出，梭菌目占比60.00%、58.50%和74.80%，巴氏桿菌目占比3.55%、35.50%和4.87%，2個菌目均明顯高于正常組，差異極顯著(P<0.01)；腹瀉組中乳桿菌目分別占比12.50%、2.00%和10.18%，與正常組相比差異不顯著(P>0.05)；腹瀉組中腸桿菌目分別占比23.95%、4.00%和10.15%，明顯低于正常組，差異極顯著(P<0.01)。與正常組腸道菌群相比，腹瀉組優勢菌群是梭菌目和巴氏桿菌目，正常組優勢菌群是腸桿菌目。

表2 細菌目水平分布分析Table 2 Analysis of the distribution of bacterial order level (%)

2.1.4 科水平分布 6個樣品共得到6個科，其中比例較高的5個科分別為腸球菌科(Enterococcaceae)、巴氏桿菌科(Pasteurllaceae)、鏈球菌科(Stretococcaceae)、梭菌科(Clostridlaceae)和腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，見表3。巴氏桿菌科、鏈球菌科和梭菌科僅在腹瀉組中檢測出，巴氏桿菌科占比 3.55%、35.50%和4.87%，鏈球菌科占比12.50%、2.00%和10.18%，梭菌科占比60.00%、58.50%和74.80%，3個菌科均明顯高于正常組，差異極顯著(P<0.01)；腹瀉組中腸球菌科占比為0，腸桿菌科分別占比23.95%、4.00%和10.15%，2個菌科均明顯低于正常組，差異極顯著(P<0.01)。與正常組腸道菌群相比，腹瀉組優勢菌群是梭菌科、鏈球菌科、巴氏桿菌科，正常組優勢菌群是腸球菌科、腸桿菌科。

表3 細菌科水平分布分析Table 3 Analysis of the distribution of bacterial family level (%)

2.1.5 屬水平分布 6個樣品共得到7個屬，其中比例較高的6個屬分別為巴氏桿菌屬(Pasteurella)、腸球菌屬(Enterococcus)、放線桿菌屬(Actinobacllus)、沙雷菌屬(Serratia)、鏈球菌屬(StrePtococcus)和梭菌屬(Clostridllus)，見表4。巴氏桿菌屬、放線桿菌屬、鏈球菌屬和梭菌屬僅在腹瀉組中檢測出，巴氏桿菌屬分別占比3.00%、0和0，放線桿菌屬分別占比0、32.00%和0，鏈球菌屬分別占比12.28%、2.00%和12.00%，梭菌屬分別占比60.00%、58.50%和74.80%，4個菌屬均明顯高于正常組，差異極顯著(P<0.01)；腹瀉組中腸球菌屬占比為0，明顯低于正常組，差異極顯著(P<0.01)；腹瀉組中沙雷菌屬占比為0，明顯低于正常組，差異極顯著(P<0.01)。與正常組腸道菌群相比，腹瀉組優勢菌群是巴氏桿菌屬、放線桿菌屬、鏈球菌屬、梭菌屬，正常組優勢菌群是腸球菌屬、沙雷菌屬。

表4 細菌屬水平分布分析Table 4 Analysis of the distribution of bacterial genus level (%)

2.2 物種豐度聚類

2.2.1 目水平物種豐度聚類 經過測序，選取主要豐度的菌目和其在每個樣品中的豐度信息，并進行聚類，見表5。腹瀉組DM-3巴氏桿菌目豐度Z值為2，遠高于正常組，差異極顯著(P<0.01)；腹瀉組梭菌目豐度Z值分別為0.5、0.5和1.5，遠高于正常組，差異極顯著(P<0.01)；腹瀉組中腸桿菌目的豐度Z值均低于腹瀉組，差異極顯著(P<0.01)；乳桿菌目豐度在2個組之間差異不顯著(P>0.05)。與正常組相比，腹瀉組中梭菌目和巴氏桿菌目豐度相對增加，腸桿菌目在腹瀉組豐度相對減少，乳桿菌目豐度并未產生明顯差異變化。

表5 細菌目水平豐度分析Table 5 Abundance analysis of bacterial order level (Z)

2.2.2 科水平物種豐度聚類 經過對6個樣本進行測序，科水平豐度見表6。腹瀉組中巴氏桿菌科豐度Z值分別為0.0、2.0和-0.5，梭菌科豐度Z值分別為0.5、0.5和1.0，鏈球菌科豐度Z值分別為1.5、-0.5和1.0，3個菌科豐度均遠高于正常組，差異極顯著(P<0.01)；腹瀉組中腸桿菌科豐度Z值分別為-0.5、-1.0和-1.0，腸球菌科豐度Z值為-0.5、2.0和0.0，2個菌科豐度均低于正常組，且差異極顯著(P<0.01)。與正常組相比，腹瀉組中梭菌科、巴氏桿菌科、鏈球菌科豐度相對增加，腸桿菌科、腸球菌科豐度相對減少。

表6 細菌科水平豐度分析Table 6 Abundance analysis of bacterial family level (Z)

2.2.3 屬水平物種豐度聚類分析 屬水平豐度分析見表7。腹瀉組中巴氏桿菌屬豐度Z值分別為2.0、-0.5和-0.5，梭菌屬豐度Z值分別為2.0、0.0和-0.5，鏈球菌屬豐度Z值分別為1.5、-0.5和1.0，放線桿菌屬豐度Z值分別為-0.5、-0.5和2.0，4個菌屬豐度均遠高于正常組，差異極顯著(P<0.01)；腹瀉組中腸球菌屬豐度Z值均為-0.5，沙雷氏菌屬豐度Z值均為-0.5，2個菌屬豐度均低于正常組，差異極顯著(P<0.01)。與正常組相比，腹瀉組中梭菌屬、巴氏桿菌屬、鏈球菌屬和放線桿菌屬豐度相對增加，腸球菌屬、沙雷菌屬豐度相對減少。

表7 細菌屬水平豐度分析Table 7 Abundance analysis of bacterial genus level (Z)

3 討論

腸道內的致病菌增多是導致水貂腹瀉的主要原因之一。目前，大多數研究表明，腸道內的單一致病菌感染或多種致病菌混合感染均可導致水貂腹瀉，于杰等[7]從死亡水貂中分離鑒定出綠色氣球菌(Greenballoonfungus)、大腸埃希菌、副傷寒沙門菌(Salmonellaparatyphi)和小腸結腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica)等細菌均可導致水貂細菌性疾病。葛俊偉等[8]首次報道了對水貂源致病性糞腸球菌的分離和鑒定。腸球菌是人和動物體內正常菌群之一，也是機會致病菌，可引起尿路感染、化膿性腹部感染、敗血癥、心內膜炎和腹瀉、發燒等多種疾病[9]。鄒積振等[10]從腹瀉水貂的臨床病例中分離出的魏氏梭菌、志賀氏菌(Shigella)[11]、沙門菌[12]、巴氏桿菌[13]也是引起水貂腹瀉的病原。王貴升[14]在對水貂腹瀉病的流行病學調查中發現，導致水貂腹瀉病的細菌病中大腸埃希菌感染的發病率最高。

根據已報道的研究并結合本試驗的結果分析，腹瀉水貂腸道微生物在綱水平上梭菌綱占比顯著增加；在目水平上梭菌目、巴氏桿菌目占比及相對豐度均顯著增加，并且乳桿菌目和腸桿菌目占比及相對豐度相對減少；在科水平上梭菌科、巴氏桿菌科、鏈球菌科占比及相對豐度顯著增加，腸球菌科、腸桿菌科占比及相對豐度相對減少；在屬水平上梭菌屬、巴氏桿菌屬、鏈球菌屬、放線桿菌屬占比及相對豐度顯著增加，腸球菌屬、沙雷菌屬占比及相對豐度相對減少。因此，可以對本試驗的水貂腹瀉做出初步診斷，根據在屬水平所檢測出的菌群及其占比和相對豐度情況，可以得出導致水貂腹瀉的原因之一為梭菌屬、巴氏桿菌屬、鏈球菌屬、放線桿菌屬等多種致病菌群增多而引起混合的感染。

目前已知的水貂腸道細菌性疾病原因比較復雜，在預防和治療的過程中困難重重[15]。因此，在了解腹瀉水貂腸道內菌種的分布和結構后，對腸道疾病的診斷有很大幫助。微生態制劑在養殖業的應用可以有效調節動物機體腸道微生態和微生物的分布、數量及種類，以維持腸道內菌群的動態平衡，達到預防和治療疾病的效果。