番鴨細(xì)小病毒NS和VP基因的克隆及序列分析

戴 銀 ， 胡曉苗 ， 趙瑞宏 ， 張丹俊 ， 潘孝成 ， 沈?qū)W懷 ， 尹 磊 ， 周學(xué)利 ， 侯宏艷

(安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 ， 安徽 合肥 230031)

番鴨細(xì)小病毒病是由番鴨細(xì)小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)引起，嚴(yán)重危害番鴨養(yǎng)殖業(yè)的急性傳染病[1]。該病主要臨床癥狀為腹瀉、呼吸困難、拒食、腳軟等，傳播方式較多，尤其是雛番鴨易感染發(fā)病，死亡率可高達(dá)80%[2-3]，對(duì)我國(guó)很多地方番鴨的健康養(yǎng)殖已經(jīng)造成嚴(yán)重影響[4-8]。MDPV為細(xì)小病毒科、依賴(lài)病毒屬成員，線(xiàn)性、單鏈DNA病毒，基因組大小約5kb。基因組包括2個(gè)開(kāi)放閱讀框(Open read frame,ORF)，左側(cè)ORF編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS，右側(cè)ORF編碼結(jié)構(gòu)蛋白 VP。NS蛋白參與病毒DNA復(fù)制及基因表達(dá)，對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用等；VP蛋白編碼的病毒粒子衣殼蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，與病毒致病力密切相關(guān)[9-12]。2種蛋白作為病毒的重要結(jié)構(gòu)成分，均具有不可替代的生物學(xué)功能。2019年本課題組對(duì)安徽省2個(gè)不同地方的MDPV毒株進(jìn)行了分離鑒定，本試驗(yàn)通過(guò)分段擴(kuò)增獲得了2株番鴨細(xì)小病毒基因組NS和VP全長(zhǎng)基因序列并進(jìn)行了分析，為下一步研究水禽細(xì)小病毒宿主差異、分子致病機(jī)理和遺傳變化規(guī)律提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株基因組DNA 番鴨細(xì)小病毒安徽分離株AH1901和AH1902基因組DNA由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存。毒株AH1901和AH1902分離于2019年，分別來(lái)自安徽合肥和安慶地區(qū)。

1.1.2 主要工具酶和試劑 DNA Marker DL2 000等，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；Taq酶、dNTP、瓊脂糖(電泳純)等，均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中MDPV毒株SAAS-SHNH的基因組序列(登錄號(hào)：KC171936)，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)5對(duì)特異性擴(kuò)增引物。P1：5′-GACATGGCACTTTCTAGG-3′，P2：5′-TAGTTCTTTGCTGCTCTGTT-3′；P3：5′-TCAACTGTAGCTCCCCTTAT-3′，P4：5′-AGACATAGCTATTTTGAATC-3′；P5：5′-GCTCTTTGCTTCAGTTGCTC-3′，P6：5′-CAGGTTCGGAGCCTTCGGTG-3′；P7：5′-ACCTGTGGCAGCACCTAA-3′，P8：5′- CGCCTTTCACAGCCTTTT-3′；P9：5′-AAAAGGCTGTGAAAGGCG-3′，P10：5′-GAACGAACCCTCCAATGA-3′。預(yù)期目的擴(kuò)增片段大小分別為680、1 270、890、809 bp和920 bp，序列拼接后基因片段全長(zhǎng)4 190 bp，包括完整的NS基因和VP基因編碼區(qū)。

1.2.2 基因組的分段擴(kuò)增 以基因組DNA為模板，分別采用P1 和P2、P3 和P4、P5 和P6、P7 和P8、P9 和P10為上下游引物擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5.0 μL，dNTP Mixture 3.0 μL,上下游引物各1.0 μL，DNA 2 μL，TaqDNA 聚合酶0.5 μL，加雙蒸水補(bǔ)足50 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，45 ℃/51 ℃/51 ℃/53 ℃/53 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，陽(yáng)性產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司純化、測(cè)序。

1.2.3 基因序列分析 應(yīng)用DNASTAR軟件拼接基因序列，DNASTAR中的Megalign程序進(jìn)行同源性分析。采用Clustal X 1.83軟件分析比對(duì)基因序列，MEGA 5.0軟件Neighbor-joining方法構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)，聚類(lèi)分析的可靠性用Bootstrap置信區(qū)限檢測(cè)，同時(shí)每1 000 Bootstrap測(cè)試結(jié)果大于50%的在節(jié)點(diǎn)上顯示。基因片段拼接后獲得NS基因和VP基因全長(zhǎng)核苷酸序列，與GenBank中登錄的MDPV、鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus,GPV)毒株相應(yīng)序列進(jìn)行對(duì)比分析。參考毒株基因組GenBank登錄號(hào)及信息見(jiàn)表1。

表1 參考毒株信息Table 1 Details of reference virus strains

2 結(jié)果

2.1 基因的擴(kuò)增 以提取的分離株AH1901和AH1902基因組DNA為模板，P1和 P2、P3和P4、P5和 P6、P7和P8、P9和P10為PCR引物，分別擴(kuò)增獲得了約680、1 270、890、809 bp和920 bp的特異性DNA片段(圖1)，并將擴(kuò)增的基因產(chǎn)物測(cè)序。獲得的序列與GenBank中登錄的MDPV全長(zhǎng)基因進(jìn)行比對(duì)，顯示均為目的基因序列。

圖1 基因組的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of viral genomeM：DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量; 1～5：分別以P1和 P2、P5和 P6、P3和P4、P7和P8、P9和P10為引物的PCR產(chǎn)物M:DNA Marker; 1-5:PCR products of P1 and P2,P5 and P6,P3 and P4,P7 and P8,P9 and P10 primers,respectively

2.2 基因序列特征 序列分析可見(jiàn)，擴(kuò)增獲得的2個(gè)MDPV基因組片段均包括完整的NS基因和VP基因，其中NS基因全長(zhǎng)1 884 bp，NS1和NS2長(zhǎng)度分別為1 884 bp和1 356 bp，二者共用同一終止密碼子；VP基因全長(zhǎng)2 199 bp，VP1、VP2和VP3長(zhǎng)度分別為2 199、1 764 bp和1 605 bp，同樣三者共用同一終止密碼子。將所有獲得的2個(gè)MDPV毒株及20個(gè)參考毒株基因核苷酸序列經(jīng)Clustal X 1.83軟件分析后可知，NS基因核苷酸替代較少，較為保守；而VP基因序列核苷酸替代較多，變異較為明顯。

2.3 遺傳進(jìn)化分析 采用MEGA分析軟件，將22條水禽細(xì)小病毒基因組序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。結(jié)果顯示，所比對(duì)的序列明顯分為GPV和MDPV兩個(gè)類(lèi)群。安徽分離毒株AH1901和AH1902基因遺傳距離較近，處于同一分支。二者與MDPV國(guó)內(nèi)分離株ZJ-JH-2013基因遺傳距離較近。與安徽分離株AH1401、AH-AQ-2015及上海分離株SAAS-SHNH遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)，尤其與P1疫苗株、匈牙利毒株FM、國(guó)內(nèi)毒株FZ91-30等5個(gè)MDPV分離株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，位于不同分支。

圖2 基因組序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of genome sequences▲：本試驗(yàn)分離的病毒株▲：The virus isolates of this experiment

2.4 基因同源性分析 將MDPV和GPV的NS基因核苷酸序列進(jìn)行同源性比較(圖3)，結(jié)果表明，所比對(duì)的基因組序列同源性介于80.9%～99.9%，其中MDPV毒株之間同源性在98.0%以上。安徽分離株AH1901與AH1902基因序列同源性為99.8%，與GPV同源性相對(duì)較低，同源性均介于81.0%～83.2%。二者與MDPV毒株ZJ-JH-2013基因序列同源性最高，均為99.8%，與上海分離毒株SAAS-SHNH同源性均為99.6%，與安徽分離株AH1401同源性均為99.5%，與毒株AH-AQ-2015分別為99.7%和99.6%。與疫苗株P(guān)1、匈牙利分離株FM序列同源性相對(duì)較低，均為98.7%。

圖3 NS基因核苷酸序列同源性Fig.3 Homology of NS nucleotide sequences

將VP基因序列進(jìn)行同源性比較(圖4)，結(jié)果表明VP基因核苷酸序列同源性介于79.6%～100.0%，其中MDPV之間同源性在88.9%以上。安徽分離株AH1901和AH1902基因序列一致，與GPV基因同源性均較低，與鵝源GPV毒株SYG61v僅為87.9%。與分離株ZJ-JH-2013、AH-AQ-2015同源性較高，達(dá)99.8%。與MDPV上海分離株SAAS-SHNH、安徽株AH1401基因序列同源性為99.7%，與疫苗株P(guān)1及國(guó)外分離株FM基因序列同源性?xún)H為88.9%和89.3%。

圖4 VP基因核苷酸序列同源性Fig.4 Homology of VP nucleotide sequences

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò)分段PCR擴(kuò)增獲得了2個(gè)MDPV安徽分離株AH1901和AH1902的NS和VP全長(zhǎng)基因，并與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄的20個(gè)MDPV、GPV基因組序列進(jìn)行了比對(duì)。序列分析可知，克隆的MDPV基因均包括完整的NS和VP基因，分別為1 884 bp和 2 199 bp；VP是主要的免疫保護(hù)性抗原基因，初步分析可見(jiàn)相對(duì)MDPV的NS基因，VP基因核苷酸序列變異程度較高，這與已有相關(guān)研究基本一致[13-14]。進(jìn)化分析顯示，分離株AH1901和AH1902遺傳距離較近，二者與2013年國(guó)內(nèi)分離的MDPV毒株ZJ-JH-2013基因序列親緣關(guān)系最近，與重組型毒株SAAS-SHNH、2014年分離的安徽毒株AH1401，尤其與疫苗株P(guān)1及匈牙利毒株FM基因序列距離相對(duì)較遠(yuǎn)。核苷酸序列同源性分析可見(jiàn)，國(guó)內(nèi)分離的MDPV基因同源性均較高，安徽分離株AH1901與AH1902的NS基因序列同源性為99.8%，與VP基因序列一致。與遺傳進(jìn)化分析結(jié)果相似，安徽分離株AH1901和AH1902與疫苗株P(guān)1及國(guó)外分離株FM的同源性均較低。此外，雖然進(jìn)化樹(shù)顯示二者與毒株AH1401、SAAS-SHNH、AH-AQ-2015位于不同分支，但與分離株ZJ-JH-2013一樣，NS基因和VP基因核苷酸序列同源性均較高。結(jié)果顯示，近年國(guó)內(nèi)的MDPV分離株總體遺傳變異程度較小，基因組特性相對(duì)穩(wěn)定[14]，但個(gè)別毒株之間仍存在一定差異，可能導(dǎo)致病毒株感染力的不同。

研究發(fā)現(xiàn)相對(duì)GPV，MDPV的宿主范圍較窄，僅感染番鴨，但經(jīng)常存在混合感染，甚至發(fā)生基因重組現(xiàn)象[15-17]。與經(jīng)典型MDPV相比，重組型MDPV對(duì)雛番鴨的致死率更高，且多見(jiàn)腸道栓塞,已在我國(guó)流行多年[18-20]。毒株AH1401與SAAS-SHNH被認(rèn)為是MDPV與GPV重組型的水禽細(xì)小病毒株[21-23]，但AH1901和AH1902與重組型MDPV毒株有一定差異，不屬于同一分支亞群。二者均是2019年在安徽省2個(gè)不同地方分離獲得的MDPV毒株，與分離株ZJ-JH-2013可能來(lái)源于同一經(jīng)典毒株。近年重組型MDPV備受關(guān)注，但經(jīng)典型毒株造成的危害也不能忽視。安徽省番鴨群細(xì)小病毒病頻發(fā)，一方面與傳統(tǒng)病毒株的變異，不科學(xué)的飼養(yǎng)管理相關(guān)，也可能與安徽流行株與使用較為廣泛的疫苗株同源性相對(duì)較低，疫苗難以有效防控有一定關(guān)系。