基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜對羊源多殺性巴氏桿菌的快速鑒定

姜彥芬 ， 王金鳳 ， 孫曉霞 ， 李睿文 ， 劉立兵 ， 袁萬哲 ， 王建昌

(1.石家莊海關技術中心 , 河北 石家莊 050050 ； 2.河北農業大學動物醫學院 ， 河北 保定 071001)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)是一種革蘭陰性短桿菌，根據其莢膜抗原差異，可歸類為A、B、D、E、F五種血清型[1]，我國主要流行的是A、B、D三種血清型。多殺性巴氏桿菌是一種在動物中廣泛存在的機會性致病菌，可引起禽霍亂、豬肺疫、豬萎縮性鼻炎，引起山羊和綿羊呼吸道疫病，引起牛和兔出血性敗血癥，也是牛呼吸道綜合征的重要細菌性病原之一[1-2]。多殺性巴氏桿菌病多發生于春、秋季節，傳播快，死亡率高，常呈地方性流行，一旦患病，將給養殖業造成重大的經濟損失，因此需要一種快速、及時準確地鑒定多殺性巴氏桿菌的方法，為該病早期防控提供有效的技術支撐。

常規細菌分離鑒定方法操作繁瑣、檢測時間較長、且需要專業的技術人員。商業化生化鑒定卡API 20E/20 NE能夠實現常見致病菌的快速、有效和便捷鑒定，但是不能有效區分多殺性巴氏桿菌和溶血性曼氏桿菌[3]。目前多殺性巴氏桿菌的分子生物學鑒定方法有16S rRNA測序、實時熒光PCR方法、環介導等溫擴增(LAMP)方法和重組酶聚合酶擴增(RPA)方法[4]，但仍需要核酸提取、靶基因擴增或基因測序和序列比對分析等步驟，同時由于操作核酸過程中容易產生氣溶膠和擴增的高靈敏性，使鑒定結果容易出現“假陽性”，導致對細菌近似種的鑒定存在無法區分。

近年來，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)作為一種新型微生物鑒定技術，已廣泛應用于食源性致病菌、動物源性致病菌和臨床微生物的快速鑒定[5]。其基本原理是微生物樣品與基質在靶板上結合形成共晶體，利用激光照射共晶體，基質從激光中吸收能量使樣品解吸附，基質與樣品之間發生電荷轉移使樣品分子電離，經過質譜飛行檢測器進行質量分析，檢測器檢測到不同質荷比(M/Z)的離子，并以離子質荷比為橫坐標，以離子峰為縱坐標形成特異性的病原菌蛋白質組指紋圖譜[6]，進而與圖庫中圖譜進行比對，從而實現對待測菌株種、屬乃至亞種水平的快速鑒定。本試驗通過MALDI-TOF MS方法，對分離自突然死亡綿羊的多殺性巴氏桿菌菌株進行鑒定，取得了與傳統生化方法和16S rRNA測序方法一致的結果。

1 材料與方法

1.1 試劑與設備 綿羊血瓊脂平板，購自河南安圖生物工程股份有限公司；營養瓊脂平板，購自青島海博生物技術有限公司；70%甲酸、乙腈、三氟乙酸(均為色譜級)，均購自賽默飛世爾科技有限公司；無水乙醇，購自天津市致遠化學試劑有限公司；色譜級α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、細菌實驗標準品(BTS)，購自德國布魯克公司；GN鑒定卡，購自生物梅里埃美國股份有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、HPLC超純水，均購自北京索萊寶科技有限公司；2×EasyTaq?PCR SuperMix，購自北京全式金生物技術公司；ZymocleanTMGel DNA Recovery Kit，購自ZYMO RESEARCH公司；pTOPO-T載體，購自北京艾德萊生物科技有限公司。

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀(Autoflex speed TOF/TOF)，德國布魯克公司；全自動微生物鑒定系統VITEK2(Compact)，美國生物梅里埃公司；ProFlexTMPCR系統(ProFlex)，美國Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 分離菌純化鑒定 無菌采集因口吐白沫、后肢癱瘓而突然死亡的綿羊肺臟和肝臟，用灼燒過的手術刀燙烙剖面，無菌剪刀剪開切面，將一次性無菌接種環插入深層組織刮蹭，分區平板劃線接種于綿羊血瓊脂，37 ℃低溫培養箱培養24 h，觀察可疑菌落形態和生長特征。挑取24 h新鮮菌落涂片進行革蘭染色。

1.2.2 MALDI-TOF MS對分離菌的鑒定

1.2.2.1 溶液配制 將色譜級乙腈、三氟乙酸和HPLC級超純水按照比例(500、25 μL和475 μL)配制出1 mL標準溶劑，于振蕩器上充分混勻，備用。取250 μL備用標準溶劑至IVD HCCA的存液管中，室溫下渦旋混勻至黃色顆粒完全溶解，獲得基質溶液。另取50 μL標準溶劑加入到IVD BTS固體顆粒管中，反復吹打混勻溶解，室溫13 000 r/min離心2 min，移取5 μL上清液，獲得BTS溶液。

1.2.2.2 分離菌提取 將分離菌使用甲酸萃取法進行蛋白樣本制備。在純化后的營養瓊脂平板上用一次性無菌接種環取足量單菌落，重懸于裝有300 μL超純水的離心管中，用移液器反復吹打，形成均勻的混懸液。加入900 μL無水乙醇，充分混勻，靜置15 min后13 000 r/min離心2 min，棄掉上清液。繼續13 000 r/min離心2 min，吸棄上清液。室溫放置至乙醇完全揮發。然后加入50 μL 70%甲酸溶液，渦旋混勻，充分重懸細菌沉淀，再加入等體積乙腈，充分混勻。13 000 r/min離心2 min獲得離心微生物萃取物。

1.2.2.3 靶板制備 取1 μL離心后上清液加到MALDI-TOF MS靶板上，待自然干燥后，在靶板上加1 μL CHCA基質溶液涂敷覆蓋。同時選取靶板另一位置靶點加1 μL BTS標準品溶液，干燥后，加1 μL CHCA基質溶液涂敷覆蓋，此靶點用于儀器的校正。室溫下晾干時間約為15 min，將靶板送入檢測倉待檢。

1.2.2.4 質譜采集和結果鑒定 運用 FlexControl 軟件對樣品進行數據采集，選擇線性操作模式和正離子模式，檢測范圍為2 000～20 000 Da。應用BioTyper 軟件將采集樣品的圖譜與數據庫中標準圖譜進行比對，結果會給出與鑒定菌最相似的10個菌種，并給出相應分值：匹配分值在2.300以上，表示菌種鑒定可信度高(+++)；匹配分值在2.000～2.299，表示可信的菌屬鑒定和可能的菌種鑒定(++)；匹配分值在1.700～1.999，表示可能的菌屬鑒定(+)；匹配分值在0.000～1.699，表示鑒定結果不可信(-)。

1.2.3 VITEK2 Compact生化鑒定 用一次性無菌接種環挑取營養瓊脂平板純培養后的單菌落，加入3 mL 0.45% NaCl鹽水，用移液器吹吸制備菌懸液。使用濁度儀調節菌懸液濃度在0.50～0.63麥氏濁度。根據細菌革蘭染色結果，選用VITEK 2 GN鑒定卡，應用VITEK2 Compact全自動微生物鑒定系統對分離菌進行生化鑒定。

1.2.4 16S rRNA測序鑒定 提取分離菌基因組DNA，根據參考文獻[7]中反應條件進行分離菌16S rRNA基因的擴增，片段大小約為1 500 bp。回收目的片段，連接pTOPO-T載體，轉化JM109感受態細胞。挑取轉化后單菌落，37 ℃搖菌，將鑒定正確的菌液送北京中科西林生物科技有限責任公司測序。登錄NCBI數據庫，利用 BLAST 程序對分離菌的測序結果進行序列比對。

2 結果

2.1 細菌分離鑒定 經24 h培養后，綿羊血平板上可見光滑、半透明、不溶血、灰白色、露珠狀小菌落。鏡檢為革蘭陰性，短桿狀細菌。

2.2 MALDI-TOF MS鑒定 通過MALDI-TOF MS 檢測及 BioTyper 軟件分析，與MALDI-TOF MS自帶數據庫中約6 000株標準指紋圖譜進行比對分析，與數據庫中10株多殺性巴氏桿菌標準菌株進行比對。結果如圖1所示，分離菌蛋白指紋圖譜基線平穩，蛋白峰多，結果良好。分離菌鑒定為“多殺性巴氏桿菌”，匹配分值為2.371，標記為(+++)，達到種水平的鑒定，說明鑒定可信度高，可完全確認菌株鑒定結果。數據庫比對結果及鑒定結果報告見圖2。

圖1 分離菌株MALDI-TOF MS蛋白質指紋圖譜Fig.1 MALDI-TOF MS protein fingerprint of bacterial isolate

圖2 分離菌株蛋白指紋圖譜與數據庫標準圖譜比對結果Fig.2 Comparison of protein fingerprint between bacterial isolate and database standard縱坐標0.0以上為分離菌株的特征峰圖譜，以下為數據庫中多殺性巴氏桿菌標準圖譜The characteristic peak map of the isolated bacteria was above the vertical coordinate of 0.0,the below was the standard fingerprint map of Pasteurella multocida in the database

2.3 VITEK2鑒定 通過VITEK2 Compact全自動微生物鑒定系統，使用VITEK 2 GN鑒定卡對分離菌的48項生化指標進行鑒定，結果鑒定為多殺性巴氏桿菌。

2.4 16S rRNA鑒定 經PCR擴增反應后，凝膠電泳結果可見大小約為1 500 bp的條帶，回收目的片段，連接pTOPO-T載體，轉化后挑取陽性克隆送菌液測序。將菌液測序結果在NCBI中進行BLAST比對，與數據庫中已公布的多殺性巴氏桿菌的參考株同源性在99.65%～99.79%，因此分離菌株鑒定為多殺性巴氏桿菌。

3 討論

羊巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起的山羊和綿羊的一種重要傳染病，多發于綿羊，經常突然發病，一旦發生，往往來不及治療，對羊養殖業造成嚴重的經濟損失。因此，對多殺性巴氏桿菌的快速、準確鑒定，可以使飼主對病畜及時采取治療，從而阻止病情愈發嚴重。

本試驗通過MALDI-TOF MS方法實現了對分離自發病綿羊的多殺性巴氏桿菌的快速鑒定，結果同傳統的生理生化方法和經典的16S rRNA測序方法鑒定結果一致。與傳統生化方法和16S rRNA測序方法相比，MALDI-TOF MS鑒定方法具有快速、準確、高通量、重復性和穩定性好的特點，能夠充分滿足疫病病原臨床診斷的要求。基于對微生物胞內固定表達的高豐度-核糖體蛋白的分析，MALDI-TOF MS法可實現對微生物高準確性和重復性的鑒定，并且不會因培養基和培養條件的不同而導致結果產生較大差異[8]。在MALDI-TOF MS檢測過程中，樣品前處理簡單易行，不需要基因組DNA的提取和PCR反應擴增，一般通過直接涂抹法或甲酸萃取法進行樣品前處理即可；上機后1 min內即可獲得鑒定結果；靶板一次可實現384個樣品高通量檢測；耗材成本低，僅需少量基質，靶板可反復清洗使用。梁達煒等研究表明，在應用MALDI-TOF MS法鑒定沙門氏菌過程中，成本約為VITEK2的1/3，檢測時間約為VITEK2的1/2[9]。謝田剛等研究表明，傳統生化鑒定方法需要3 h左右獲得對銅綠假單胞菌的鑒定結果，而MALDI-TOF MS方法則僅需要30 min左右[10]。研究表明，在樣品前處理過程中，采用直接涂抹法雖然簡便，但因其容易受涂布菌量、培養基基質和涂抹均勻程度的影響，導致圖譜重復性交叉，鑒定結果不準確；使用甲酸萃取法得到的蛋白指紋圖譜基線更平穩，蛋白峰更多，重復性更好[11]。本試驗中，從獲得純菌落到得到細菌鑒定結果，VITEK2方法需要4 h左右，16S rRNA測序方法則至少需要2 d；而 MALDI-TOF MS采用甲酸萃取法進行樣品前處理，則僅需要約30 min即可獲得鑒定結果。

MALDI-TOF MS對細菌進行鑒定的同時，還可以基于數據庫進行同源性分析，對分離菌株進行溯源[12-13]。基于質譜儀構建數據庫功能，可以將某一地區或農場分離的多殺性巴氏桿菌進行蛋白指紋分析，獲得所有分離株的蛋白指紋圖譜后，自建該地區或農場的多殺性巴氏桿菌數據庫，進而能夠快速獲得新分離多殺性巴氏桿菌的鑒定結果，同時可以進行細菌聚類分析。通過聚類分析，構建系統樹，可以分析細菌在不同差異水平時的分型，從而進一步分析菌株之間的親緣關系，實現對新分離多殺性巴氏桿菌的有效溯源。這也是本課題組下一步研究的重要內容。