河南許昌地區規模化肉雞場滑液囊支原體的分離鑒定及耐藥性檢測

李水德

(許昌市建安區職業中等專業學校 ， 河南 許昌 461143)

支原體主要感染禽類及哺乳動物的呼吸系統和生殖系統，還可引發關節炎、乳腺炎和眼炎等[1]。國內相關研究顯示，危害禽類的支原體有28種，臨床以雞毒支原體、雞滑液囊支原體和火雞支原體3種較為常見，尤其是雞滑液囊支原體和雞毒支原體感染最為嚴重，其對種雞感染率可達50%以上，支原體感染先后在加拿大、英國、挪威、德國、法國、南非等國家報道，呈世界性分布，給養雞業造成嚴重的經濟損失[2-3]。國外研究表明，雞滑液囊支原體和雞毒支原體對肉種雞危害較嚴重，尤其雞滑液囊支原體感染率可達20%以上，主要防控措施以凈化為主[4]。雞滑液囊支原體病以關節腫大、滑液囊、肌腱炎及實質器官的腫大為主要特征，病雞和隱性感染雞群是主要傳染源，該病一旦在雞群中感染可引發一系列疾病，導致雛雞生長遲緩，嚴重者可導致死亡，產蛋雞產量下降，且易與其他病原體混合感染，很難根除，給養雞業造成嚴重的經濟損失[5-6]。臨床中支原體主要通過抗生素防控，隨著抗生素的使用，其耐藥性越來越嚴重，耐藥菌株逐漸增多，嚴重影響其治療效果[7]。本試驗主要對許昌地區規模化肉雞場滑液囊支原體感染情況進行檢測，并分析其耐藥性，為該地區的肉雞場雞滑液囊支原體臨床合理用藥及防控提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2018—2019年，采集許昌地區規模化肉雞場疑似滑液囊支原體感染的病料組織179份。

1.2 主要試劑 PPLO液體培養基、改良Frey液體培養基、改良Frey固體培養，均購自廣東環凱微生物科技有限公司；抗支原體類抗菌藥的藥敏紙片，購自北京天壇藥物生物技術開發公司；DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒，均購自北京索萊寶科技有限公司；DL 2 000 Marker、2×TaqMaster Mix，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離與培養 取疑似雞滑液囊支原體感染的關節液病料組織，經過處理后接種于Frey液體培養基內密封，37 ℃恒溫培養36～44 h，每日觀察2～3次，待顏色變黃后過濾，傳代4次后，將其接種于改良Frey固體培養基上，37 ℃恒溫5%CO2培養箱中培養4～7 d，肉眼觀察直到出現中央凸起呈荷包蛋樣的典型支原體菌落，姬姆薩染色觀察其形態學。

1.3.2 菌株DNA基因組提取 取中央凸起呈荷包蛋樣的典型支原體菌落的菌株，按照DNA提取試劑盒說明書提取其菌株的DNA基因組，-20 ℃保存。

1.3.3 菌株PCR鑒定 參考文獻[8]報道的雞滑液囊支原體鑒定引物，根據GenBank中登錄的雞滑液囊支原體基因全序列，設計vlhA基因鑒定引物：5′-CACCGCCATTGCTCCTGTTATA-3′，5′-GGGTAGT-CCACTCGCACCTCTCGCATT-3′，目的片段大小為773 bp，引物由華大基因科技研究公司合成。以提取的菌株DNA基因組為模板，進行PCR鑒定，挑取鑒定陽性菌株用膠回收試劑盒回收PCR產物，送華大基因進行測序，其測序結果與NCBI網站下載參考株的基因序列用BLAST軟件進行同源性比對。

1.3.4 藥敏試驗 將分離菌株接種于PPLO液體培養基中，均勻涂布在PPLO固體培養基上，每個培養基貼6種抗菌藥紙片，每種抗菌藥3個重復，取平均值。參照美國臨床檢驗標準委員會(NCCLS)推薦的標準進行結果判斷，分析其耐藥性。

2 結果

2.1 分離培養 疑似雞滑液囊支原體在改良Frey固體培養基上，37 ℃恒溫5%CO2培養箱中培養4 d時，出現光滑、透明、圓形、似露珠狀的菌落，呈現典型的“煎蛋樣”菌落(圖1)；通過吉姆薩染色油鏡下可見卵圓形、彎曲的絲狀、螺旋狀等多形態菌株(圖2)，與《伯杰細菌鑒定手冊》中支原體培養特性、形態學基本一致。經過統計87株菌株初步鑒定為支原體。

圖1 菌株的“煎蛋樣”菌落Fig.1 “Fried egg like” colonies of the strain

圖2 顯微鏡下的菌株形態(1 000×)Fig.2 Microscopic morphology of the strain(1 000×)

2.2 PCR鑒定 對初步鑒定的87株支原體，用雞滑液囊支原體vlhA基因鑒定引物進行PCR鑒定，結果顯示，87株支原體均擴增出大小約為773 bp的目的條帶(圖3)，其測序結果用BLAST軟件進行同源性比對，分離的87株雞滑液囊支原體與GenBank中登錄的參考株同源性介于97.9%～99.7%。

圖3 雞滑液囊支原體分離株的PCR鑒定結果Fig.3 PCR identification results of Mycoplasma synovialis stainsM:DL-2 000 marker； 1～5:分離菌株； 6:空白對照M：DL-2 000 marker; 1-5:Isolated strains; 6:Blank control

2.3 耐藥性分析 用K-B藥敏紙片法對分離的87株雞滑液囊支原體進行藥敏試驗，分析其耐藥性。結果如表1所示，分離的87株雞滑液囊支原體對臨床中不同的抗菌藥均產生耐藥性，對金霉素、土霉素、吉他霉素、替米考星、多西環素、泰樂菌素和林可霉素耐藥率分別為98.8%、94.3%、90.7%、78.2%、61.5%、58.8%和57.7%，對阿奇霉素、泰妙菌素、環丙沙星、恩諾沙星和沙拉沙星5種抗菌藥耐藥率較低，耐藥率介于10.3%～17.9%。

表1 87株雞滑囊支原體的耐藥試驗結果Table 1 Drug resistance test results of 87 Mycoplasma synovialis strains

臨床中分離的87株雞滑液囊支原體呈現多重耐藥性，耐12種抗菌藥有2株、耐11、3種抗菌藥各有4株、耐10種抗菌藥有5株、耐9、4種抗菌藥各有7株、耐5種抗菌藥有12株，其中耐8、7、6種抗菌藥分離菌株最多，分別占分離菌株的16.1%、17.2%和19.5%(圖4)。

圖4 多重耐藥性檢測結果Fig.4 Results of multidrug resistance test

3 討論

雞滑液囊支原體可以引起不同階段的雞和火雞發生傳染性滑膜炎、呼吸系統、全身性疾病及自身免疫性疾病等一系列疾病，呈世界性流行[8-9]。雞滑液囊支原體發病無明顯的季節性，一年四季均可發生，以冬春季節易發，可以感染各種日齡雞，該病可以水平傳播也可以垂直傳播，尤其是種雞通過卵傳播給子代，在種雞感染初期經卵傳播率較高，不同菌株具有不同的致病力，且在雞群中長期存在[10-11]。招麗嬋等[3]報道從廣東、廣西、江蘇、浙江、福建等10個不同地區養殖場中分離到96 株雞滑液囊支原體田間流行株。王昆等[7]從山東濰坊市某養雞場分離得到雞滑液囊支原體。說明該支原體在全國雞場廣泛流行。規模化養殖場中該支原體廣泛流行主要是由于防控措施不健全、生物安全的漏洞等，不注重該病原體的凈化，是導致其流行的主要原因之一。本試驗從許昌地區規模化肉雞場采集疑似雞滑液囊支原體感染的179份病料組織中分離得到87株雞滑液囊支原體，說明該地區雞滑液囊支原體感染嚴重，應該注意其防控與凈化。

由于該病疫苗效果不太理想，臨床中主要用抗生素進行防控，由于抗生素的不合理使用，導致其耐藥菌株出現，給該病的防治帶來了一定的困難[12]。當發生雞滑液囊支原體感染時應該進行藥敏試驗，選擇敏感藥物合理使用，提高治療效果，同時配合消毒。本試驗結果顯示，分離的雞滑液囊支原體對臨床中常用抗菌藥均出現嚴重耐藥性，應該引起重視。本試驗結果與隋兆峰等[12]、石曉磊等[13]報道的雞滑液囊支原體耐藥性存在一定差異性，可能與地區及使用抗菌藥的種類有關。本試驗結果為許昌地區規模化肉雞場滑液囊支原體的防控提供了參考依據。