橙皮苷抑制LPS誘導的腸上皮細胞炎性損傷及其機制研究

鐘 佳 ， 卞藝斐 ， 劉 萍 ， 周期律 ， 鐘 沅 ， 劉鐘杰

(1. 山西農業大學動物醫學學院 ， 山西 太谷 032699 ； 2.山東中醫藥大學中醫藥創新研究院 ， 山東 濟南 250355 ；3.浙江農林大學動物科技學院·動物醫學院 ， 浙江 臨安 311300 ； 4.中國農業大學動物醫學院 ， 北京 海淀 100193)

橙皮苷(Hesperidin，HSD)是一種廣泛來源于柑橘類水果的黃酮類化合物，具有抗炎、抗應激、抗氧化、降脂和胰島素增敏等特性，有利于治療神經、精神和心血管等疾病[1]。研究發現，橙皮苷可改善試驗性結腸炎大鼠腸道吸收功能，緩解腸道炎癥，恢復上皮屏障完整性[2]。腸上皮參與調節病原菌誘導的黏膜免疫反應，維持黏膜組織的穩態[3]。在炎癥狀態下，腸上皮細胞核轉錄因子NF-κB被激活，觸發炎性細胞因子、趨化因子的產生，從而導致多種信號通路啟動，并調控炎癥基因表達的轉錄和轉錄后事件，參與炎癥反應，引起細胞損傷。本研究應用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導大鼠小腸隱窩上皮細胞(IEC-6)炎性損傷模型，探究橙皮苷對腸上皮細胞炎性損傷的保護作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品 橙皮苷標準品(B20182，HPLC≥98%)，購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 主要試劑 IEC-6細胞株，購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心；高糖DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶，均購自Biological Industries公司；LPS(L2630)，購自Sigma公司；CCK8試劑盒(CK04)，購自東仁化學科技公司；乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)細胞毒性檢測試劑盒(C0017)，購自上海碧云天生物技術有限公司；大鼠腫瘤壞死因子(TNF-α)ELISA試劑盒(438204)，購自BioLegend公司；NLRP3、Caspase-1、IL-1β、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IκB和IκB大鼠單克隆抗體，均購自Abcam公司。

1.3 主要儀器 CO2培養箱(日本Sanyo公司)；酶標儀(Thermo Scientific公司)；高速離心機(美國Scilogex公司)；蛋白電泳儀、電泳槽(BIO-RAD公司)；化學發光成像儀(上海勤翔科學儀器有限公司)。

1.4 試驗方法

1.4.1 IEC-6細胞培養 參照文獻[4]所述方法培養IEC-6細胞。

1.4.2 CCK-8試驗篩選橙皮苷作用濃度 IEC-6細胞以1×104個/孔接入96孔細胞培養板中，待細胞長至70%～80%融合狀態，用含不同濃度橙皮苷(0～80 μmol/L)的培養基替換原培養基，培養24 h后吸棄藥液，加入含10% CCK-8的DMEM培養基100 μL，37 ℃避光培養2 h，450 nm波長檢測吸光度。

1.4.3 LDH試驗檢測IEC-6細胞膜完整性 按照1.4.2所示方法接種IEC-6細胞并用含不同濃度的橙皮苷培養基預處理細胞24 h，吸棄培養基，加入100 μL含40 μg/mL LPS的培養基,培養12 h后收集細胞上清，參照LDH檢測試劑盒說明書檢測LDH釋放量。

1.4.4 細胞劃痕試驗檢測上皮細胞細胞遷移能力 IEC-6細胞以106個/孔接種到6孔板中,當細胞增長至70%時,培養基置換為含或不含20 μmol/L橙皮苷的培養基，預處理細胞24 h后,使用200 μL的槍頭,垂直于培養板劃出3條直線。PBS緩沖液清洗細胞碎片2～3次后,分別加入含或不含40 μg/mL LPS的培養基,并在刺激0、12 h和24 h時使用倒置顯微鏡觀察各組細胞的遷移變化，每個孔選擇6個固定位點進行拍照。

1.4.5 細胞TNF-α分泌量的測定 細胞以106個/孔接種到6孔板,并培養至細胞達到90%單層融合狀態。用橙皮苷(10 μmol/L和20 μmol/L)預處理細胞24 h，后清除培養基，加入100 μL含10 μg/mL LPS的培養基繼續培養12 h，收集細胞上清，根據大鼠ELISA試劑盒說明書進行炎性因子TNF-α分泌水平的測定。

1.4.6 Western blot檢測NLRP3、Caspase1、IL-1β、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IκB、IκB蛋白的相對表達 經1.4.5步驟處理后，貼壁細胞用冷PBS洗2次，加入RIPA細胞裂解液裂解20 min,提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。各組取蛋白質20 μg/孔,通過10%的SDS-PAGE,半干轉膜法轉移至PVDF膜,用5%脫脂牛奶封閉2 h,一抗4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液清洗3次，加入二抗繼續孵育1 h,ECL顯色液顯影。

1.4.7 數據處理 IBM SPSS 17.0軟件對試驗結果進行分析處理。試驗數據以平均值±標準誤(Mean±SEM)表示，單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗試驗組間差異性。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 橙皮苷對IEC-6細胞活性的影響 由圖1可知，與空白對照組相比，5～80 μmol/L橙皮苷作用組IEC-6細胞活性無明顯變化(P>0.05)。選擇5、10、20、40 μmol/L和60 μmol/L橙皮苷作用濃度用于后續試驗。

圖1 橙皮苷對IEC-6細胞存活率的影響Fig.1 Effect of hesperidin on IEC-6 viability

2.2 橙皮苷對LPS誘導IEC-6細胞損傷的影響 由圖2可知，與空白對照組(不加LPS和HSD)相比，40 μg/mL LPS作用IEC-6細胞12 h(模型對照組)顯著增加了細胞LDH釋放率(P<0.05)。而橙皮苷(5～60 μmol/L)預處理24 h顯著抑制了LPS誘導的LDH釋放率增加(P<0.05)。

圖2 橙皮苷對LPS誘導IEC-6細胞LDH釋放率的影響Fig.2 Effect of hesperidin on LDH release rate in IEC-6 induced by LPS*：與空白對照組比較，P<0.05； #：與模型對照組比較，P<0.05;下圖同*:Compared with control group,P<0.05; #:Compared with LPS group, P<0.05. The same as below

2.3 橙皮苷對LPS誘導IEC-6細胞遷移的影響 由圖3可知，與空白對照組相比，40 μg/mL LPS作用IEC-6細胞24 h顯著抑制了細胞劃痕愈合率(P<0.05)，而20 μmol/L橙皮苷預處理24 h顯著逆轉了LPS對IEC-6細胞劃痕愈合的抑制作用(P<0.05)。此外，LPS刺激細胞12 h并未引起IEC-6細胞劃痕愈合率的顯著變化(P>0.05)。

圖3 橙皮苷對LPS誘導IEC-6細胞劃痕愈合率的影響Fig.3 Effect of hesperidin on wound closure in IEC-6 induced by LPSA：IEC-6細胞在LPS刺激12 h和24 h時細胞遷移情況(20×)； B：劃痕愈合率A:Migration of IEC-6 cells stimulated by LPS for 12 h and 24 h (20×); B:Scratch healing rate

2.4 橙皮苷對LPS誘導炎性因子TNF-α分泌的影響 由圖4可知，與空白對照組相比，10 μg/mL LPS刺激IEC-6細胞12 h引起TNF-α分泌水平的升高(P<0.05)，而橙皮苷(10 μmol/L和20 μmol/L)預處理24 h抑制了LPS誘導的這種變化(P<0.05)。

圖4 橙皮苷對LPS誘導IEC-6細胞TNF-α分泌的影響Fig.4 Effect of hesperidin on release of TNF-α in IEC-6 induced by LPS

2.5 橙皮苷對NLRP3通路蛋白表達水平的影響 由圖5可知，與空白對照組相比，10 μg/mL LPS誘導pro-Caspase-1和Caspase-1的蛋白表達量，且Caspase-1/pro-Caspase-1比值顯著升高(P<0.05)。與模型對照組相比，橙皮苷(10 μmol/L和20 μmol/L)預處理24 h顯著降低pro-Caspase-1 和Caspase-1(p10)蛋白表達水平及Caspase-1/pro-Caspase-1比值(P<0.05)。10 μg/mL LPS在存在或不存在橙皮苷(10 μmol/L和20 μmol/L)預處理下均未引起NLRP3和IL-1β的蛋白表達量顯著改變(P>0.05)。

圖5 橙皮苷對LPS誘導IEC-6細胞NLRP3,pro-Caspase-1，Caspase-1和 IL-1β蛋白表達水平的影響Fig.5 Effect of hesperidin on NLRP3,pro-Caspase-1，Caspase-1 and IL-1β protein expression in IEC-6 induced by LPS

2.6 橙皮苷對NF-κB通路蛋白表達水平的影響 由圖6可知，與空白對照組相比，10 μg/mL LPS誘導p-IκB/ IκB比值顯著降低(P<0.05)。與模型對照組相比，橙皮苷(20 μmol/L)預處理24 h顯著增加了p-IκB/ IκB比值(P<0.05)。10 μg/mL LPS在存在或不存在橙皮苷(10 μg/mL、20 μmol/L)預處理下均未引起p-NF-κB p65和NF-κB p65的蛋白表達量顯著改變(P>0.05)。

圖6 橙皮苷對LPS誘導IEC-6細胞p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IκB和 IκB蛋白表達水平的影響Fig.6 Effect of hesperidin on p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IκB and IκB protein expression in IEC-6 induced by LPS

3 討論

黃酮類化合物作為一類植物源性膳食化合物，因其強大的抗氧化和抗炎作用而備受關注[5]。腸道炎作為危害牲畜健康和生產性能的重要疾病，嚴重影響畜牧業的發展。研究表明，橙皮苷通過其抗氧化和抗炎作用發揮保護腸道的作用[6]。體內試驗發現，橙皮苷能夠保護腸上皮細胞的存活，恢復上皮屏障的完整性[7]。然而，橙皮苷對LPS誘導的腸上皮細胞炎性損傷的作用及其作用機制還未有相關報道。本研究利用LPS刺激大鼠小腸隱窩上皮細胞(IEC-6)建立體外上皮細胞炎性損傷模型，從腸上皮炎性損傷層面評估了橙皮苷在腸源細菌性疾病進程中的作用。

腸道上皮損傷與腸道病原體和細菌性毒素引起的許多疾病的發病機制有關[8]。本研究結果發現，橙皮苷抑制高濃度LPS誘導的IEC-6細胞的LDH釋放率增加，反映了橙皮苷能夠維持腸上皮細胞細胞膜的完整性。另外，橙皮苷顯著逆轉了LPS對IEC-6細胞遷移能力的抑制作用，這在一定程度上說明橙皮苷有增強腸上皮單層損傷愈合的能力。

在細菌感染過程中，模式識別受體(Pattern recognition receptor，PRRs)識別相應病原相關分子模式(Pathogen-associated molecular pattern，PAMP)并啟動固有免疫，通過降解IκB介導NF-κB信號通路激活，啟動IL-1β和TNF-α等炎性因子轉錄，誘發細胞炎性損傷。研究表明，活化的NF-κB可誘導細胞炎性小體形成[9]。NLRP3 炎性小體是目前研究最廣泛的炎性小體，當NLRP3 活化后，與ASC 發生相互作用，招募Caspase-1 前體蛋白，并誘導自我催化，形成p20和p10亞基，進而形成具有活性的Caspase-1，成熟的Caspase-1能夠活化IL-1β和IL-18，進而誘發級聯放大炎性反應，直接影響上皮細胞的活性與功能。研究表明，NF-κB和炎性小體在維持腸上皮屏障功能中發揮重要的作用[10]。本研究檢測了LPS作用下IEC-6細胞炎癥相關核轉錄因子NF-κB及炎性小體通路蛋白的表達，結果發現，橙皮苷顯著抑制了LPS誘導的Caspase-1和IκB的激活，進而抑制了炎性因子TNF-α的分泌增加。

在腸道炎癥反應中，上皮細胞以其獨特的定位，被視作是腸道免疫的主要參與者，LPS等多種細菌致病產物直接作用于腸上皮細胞，廣泛激活黏膜免疫應答，加速免疫介導的腸道炎癥的發生和發展。本研究證明了橙皮苷可以通過調控NF-κB和炎性小體通路蛋白的表達以抑制LPS誘導的腸上皮細胞炎性損傷，為橙皮苷等黃酮類化合物在腸源性疾病中的運用提供理論支持。