一種新HBsAg化學發光試劑盒的研制

沈冬 溫江濤

[摘要] 目的 評價一種新HBsAg化學發光定量試劑盒主要性能指標。 方法 對2019年8月16日至2020年1月15日南京醫科大學附屬蘇州科技城醫院5035例陰性體檢標本、209例陰性住院患者標本和101例潛在交叉反應樣本進行了檢測。對30個血清盤和434份預選陽性標本（包括基因型和亞型）進行敏感度檢測。對25個突變株進行檢測。對不同基因型進行敏感度試驗。對25例HBsAg陽性和27例HBsAg陰性血清/血漿樣本進行血清-血漿等效性檢測。 結果 該HBsAg試劑盒檢測特異度為99.96%，敏感度為100.00%。在30個血清盤中，該試劑與雅培HBsAg試劑敏感度相同，比列出的最不敏感試劑早123 d，平均提前4.1 d。突變株的檢測能力相同。稀釋基因型組中每個樣本的敏感度均<0.13 IU/ml。所有配對樣本均顯示血清-血漿等效性。結論 該HBsAg定量試劑性能優良，適合臨床應用。

[關鍵詞] HBsAg;化學發光;定量分析;特異度;敏感度

[中圖分類號] R392.3? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）07-0126-05

Performance of a new chemiluminescent HBsAg quantitative assay

SHEN Dong WEN Jiangtao

Department of Clinical Laboratory， the Affiliated Suzhou Science & Technology Town Hospital of Nanjing Medical University， Suzhou? ?215153， China

[Abstract] Objective To evaluate the main performance indicators of a new HBsAg chemiluminescence quantitative kit. Methods From August 16， 2019 to January 15， 2020， 5，035 negative physical examination specimens， 209 negative inpatients′ specimens， and 101 potential cross-reactive specimens were tested in our hospital. Sensitivity testing was performed on 30 serum plates and 434 pre-selected positive samples （genotype and subtype）. Twenty-five mutant strains were tested. Sensitivity tests were performed for different genotypes.Serum-plasma equivalence tests were performed on 25 HBsAg-positive and 27 HBsAg-negative serum/plasma samples. Results The detection specificity and the sensitivity of the HBsAg kit were 99.96% and 100.00%， respectively. In the 30 serum plates， the reagent had the same sensitivity as the Abbott HBsAg reagent， 123 days earlier than the least sensitive reagent listed， and 4.1 days earlier on average. The detection ability of mutant strains was the same. The sensitivity of each sample in the diluted genotype group was <0.13 IU/ml. All matched samples showed serum-plasma equivalence. Conclusion The HBsAg quantitative kit has excellent performance and is suitable for clinical application.

[Key words] HBsAg; Chemiluminescence; Quantitative analysis; Specificity; Sensitivity

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是肝硬化和肝細胞癌的主要病因[1-3]。在HBV感染窗口期乙型表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）水平低于檢測限[4]。也有報道丙肝病毒（hepatitis C virus，HCV）/艾滋病病毒（human immunodeficiency virus，HIV）共感染可導致HBsAg檢測不到[5]。HBsAg免疫逃逸突變，特別是在“a”決定簇內，可能改變蛋白質的抗原性，導致抗-HBs抗體中和HBsAg失敗。HBsAg突變有三種主要形式：氨基酸替換、插入和缺失[6]。最具特征的逃逸突變是G145R[7]。HBsAg檢測敏感度不斷提高可降低輸血相關性乙肝的感染。近年來，定量HBsAg免疫分析已廣泛應用于臨床[8-11]。高敏感度和特異度、突變檢測能力和定量化是HBsAg檢測的主要發展趨勢。本研究是一種新型吖啶酯標記的化學發光免疫分析方法，用于定量測定人血清和血漿中的HBsAg，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

5035例陰性標本來自醫院體檢樣本，雅培（Architect）HBsAg檢測結果均為陰性。209例陰性住院患者標本。101份具有潛在交叉反應的HBsAg陰性樣本，包括：血管炎患者（6例）、類風濕因子（8例）、膠原病患者（3例）、多產孕婦（6例）、高IgG/IgM患者（8例）、流感疫苗接種者（6例）、慢性腎功能不全患者（6例）、梅毒患者（7例）、艾滋患者（6例），丙型肝炎患者（7例）、EB病毒患者（5例）、巨細胞（8例）、帶狀皰疹患者（5例）、單純皰疹病毒患者（5例）、甲型肝炎患者（6例）、戊型肝炎患者（8例）和橋本甲狀腺炎患者（1例）。

所有標本凍存于-20℃冰箱。避免反復凍融。本研究經南京醫科大學附屬蘇州科技城醫院醫學倫理委員會批準（批準文號：IRB2021046），參與者均簽署知情同意書。

1.2 方法

全自動化學發光分析儀和試劑盒由蘇州長光華醫生物生物工程有限公司（Hybiome）研發生產。Hybiome HBsAg分析是一種化學發光免疫分析兩步法，使用生物素化的抗乙肝表面抗體（hepatitis B surface antibody， HBs）小鼠單克隆抗體和吖啶標記的抗HBs山羊多克隆抗體捕獲和檢測人血清或血漿中的HBsAg。

1.3 觀察指標及評價標準

1.3.1 方法學比對? 用Architect HBsAg試劑檢測乙肝五項的5779份標本，經Hybiome HBsAg檢測系統檢測并與雅培結果比對，出現不一致結果用羅氏Elecsys HBsAg Ⅱ試劑復核。敏感度=真陽性例數/（真陽性例數+假陰性例數）×100%，特異度=真陰性例數/（真陰性例數+假陽性例數））×100%。

1.3.2 定量檢測的相關性分析? 將434例陽性標本在Architect和Hybome兩個檢測系統上的定量結果進行相關性分析。

1.3.3 突變樣本檢出率? 用Hybiome HBsAg、Architect HBsAg和Elecsys HBsAg-Ⅱ檢測15個天然突變體和10個DiaSorin-rec HBsAg突變體（重組）。

1.3.4 血清盤? 30個市售血清盤來自Zeptometrix（27個）、Seracere（2個）和Biomex（1個）。將Hybiome與Architect HBsAg同時檢測的結果進行比較，并與最低和最敏感的檢測數據進行比較。

1.3.5 不同基因型的檢測效率? HBV基因型小組（PEI6100/09）：該小組由10個基因型組成：A1、A2、B2、C2、D1、D2、D3、E、F2和H。

1.3.6 血清-血漿等效性? HBsAg陰性血清/血漿對：收集同一HBsAg陰性受試者（27例）的血清和血漿（枸櫞酸鈉、K2EDTA、K3EDTA、肝素鋰、CPD、CPDA、肝素鈉、ACD-B、草酸鉀/氟化鈉）。收集到同樣的25例HBsAg陽性血清/血漿對。用已知的HBsAg陽性樣本對每個樣本進行加標（加標率為0.25%～10.00%），以獲得分布在診斷范圍內的不同HBsAg濃度的25個樣本。

1.4 統計學方法

本研究使用保羅埃利希研究所建立的兩次測定之間的時間延遲計算模型。與平行參考試劑Architect HBsAg定量法比較計算總數，并與最敏感和最不敏感測定法比較計算總延遲天數。使用SPSS 13.0統計學軟件計算平均值、標準差、變異系數（CV）、回歸斜率和相關系數。

2 結果

2.1 方法學比對

采用Hybiome HBsAg和Architect HBsAg同時檢測5779份標本，結果表明，兩種試劑的陽性符合率為100.00%（434/434），陰性符合率為99.96%（5343/5345），總符合率為99.96%（5777/5779）。有兩個不一致的樣本，經試驗確認，一例為陰性，另一例為陽性。因此，Hybiome HBsAg試劑的敏感度和特異度分別為99.77%（434/435）和99.98%（5343/5344）。見表1。

2.2 兩種HBsAg定量方法的相關性分析

Hybome HBsAg檢測與Architect HBsAg定量檢測的相關性分析（n=434）。X和Y軸分別為Architect和Hybiome的HBsAg水平。兩種分析方法相關性很高（r=0.953）。見圖1。

2.3 HBsAg天然和重組突變樣本的檢測

用Hybiome HBsAg、Architect HBsAg和Elecsys HBsAg-Ⅱ（瑞士羅氏公司）檢測DiaSorin-rec HBsAg突變體和天然突變體。三種試劑漏檢了T123N、T124S和P124L、F/Y1543H、D144E和G145R重組突變體。對15個天然突變體均無漏檢，且濃度相近。見表2。

2.4 血清盤

共有30個商品化血清盤（1個Biomex、2個SeraCare和27個ZeptoMetrix）。用Hybome HBsAg和Architect HBsAg同時檢測。將Hybiome HBsAg與Architect HBsAg的結果進行比較，并與最低和最敏感的檢測數據進行比較。保羅埃利希研究所也采用了這一原則。因此，Hybome HBsAg檢測試劑盒與最低和最敏感的HBsAg檢測之間的總延遲天數和平均延遲天數見表3。Hybome HBsAg總延遲天數為1301 d，比Abbott Architect HBsAg晚10 d，比最不敏感試劑早123 d，比最敏感試劑晚140 d。

2.5 不同基因型的檢測效率

第一國際參考組（PEI 6100/09）的HBV基因型檢測，每個小組的最低濃度仍與HBsAg檢測試劑盒反應。見圖2。結果表明，所有基因型的檢測效率基本相同。所有基因型在濃度<0.13 IU/ml時均能檢出。

2.6 血清-血漿等效性

用Hybiome HBsAg試劑盒檢測27例陰性血清和血漿（枸櫞酸鈉、K2EDTA、K3EDTA、肝素鋰、CPD、CPDA、肝素鈉、ACD-B、草酸鉀/氟化鈉）。所有樣本均為陰性，即值<0.05 IU/ml。檢測25個加標血清和血漿（檸檬酸鈉、K2EDTA、K3EDTA、肝素鋰、CPD、CPDA、肝素鈉、ACD-B、草酸鉀/氟化鈉），所有樣本均陽性，即值≥0.05 IU/ml。為了評估血清和不同血漿基質之間的測量值是否存在差異，根據CLSI EP09-A3分析數據，結果（估計值和95%置信區間）。見表4。

所有血漿類型的估計相關系數均為1.00（介于0.997～0.999之間）。估計的回歸斜率在0.98和1.02之間變化。因此，含檸檬酸鈉、K2EDTA、K3EDTA、肝素鋰、CPD、CPDA、肝素鈉、ACD-B和草酸鉀/氟化鈉抗凝劑的血清和血漿可被認為是等效的，適用于Hybiome HBsAg試劑盒進行檢測。

3 討論

HBV是全球報道的最常見的病毒感染。HBsAg是HBV感染的關鍵標志物，在HBV感染過程中首先出現在受感染的血清中。但在HBV感染窗口期或存在HBsAg突變時HBsAg很難被檢測出來。許多研究表明，血清HBsAg濃度與HBVDNA有很好的相關性，尤其是HBeAg陽性患者。此外，血清HBsAg濃度與肝臟HBV-DNA和cccDNA相關性良好，優于血清HBV-DNA，提示血清HBsAg可作為肝臟cccDNA的間接標志物。HBsAg檢測試劑盒是識別HBV感染者的一線篩查工具。近年來，定量HBsAg免疫分析已廣泛應用于臨床。高敏感度和特異度、突變檢測能力和定量化是HBsAg檢測的主要發展趨勢。

HBsAg檢測的高敏感度可提高血液安全性，降低輸血傳播乙肝病毒感染的風險。HBsAg測試之間的分析敏感度差異非常大，可達300倍（0.013～4.000 IU/ml）。本次實驗中，新開發的 Hybiome HBsAg試劑盒檢測顯示，與血清盤中非常敏感的替代檢測相比，其敏感度高。這意味著Hybiome可以盡快檢測出HBV感染。

研究報道HBV基因型和亞型變異會影響HBsAg的敏感度[12-13]。然而，Hybiome HBsAg試劑盒沒有遺漏任何陽性樣本。除了早期感染的窗口期外，HBsAg檢測可能由于突變而漏檢，包括改變HBsAg抗原性的“a”決定簇突變。關于特定人群中突變頻率的數據很少，例如，泰國個體的突變頻率為0.1%[14]。在東南亞，HBsAg陽性獻血者中HBV突變的頻率在1.0%～3.7%之間[15]。G145R突變比較常見[16-18]，表明它是最常見的突變，需要在分析設計中加以考慮。許多試劑商已經優化了他們的HBsAg檢測方法，使用多個捕獲的抗野生和變異HBV的單克隆抗體代替一個單克隆抗體，并用多克隆抗體代替單克隆示蹤抗體[19-20]。多克隆示蹤劑抗體在提高突變檢測能力的同時，也限制其特異性。Hybiome HBsAg試劑盒中兩個HBsAg抗體至少各自包含一種抗S蛋白單克隆抗體，兩種抗S蛋白單克隆抗體針對的HBsAg的表位不同，本研究的試劑盒在國際上尚屬首例，在檢測HBsAg時具有高靈敏感度和準確度，極大提高了HBsAg突變株的檢出能力。Hybiome與其他CE標記的檢測試劑盒相比，幾乎是最好的，包括雅培PRISM HBsAg試劑盒和羅氏HBsAg Ⅱ試劑盒。

Hybiome HBsAg試劑盒檢測特異度高達99.96%，超過歐盟標準的99.5%，無天然或重組突變假陰性。在30個血清盤中，Hybiome HBsAg檢測試劑盒與Architect HBsAg參考檢測試劑盒具有相似的敏感度。這幾乎是最敏感的發光標記分析。所有基因型均在<0.13 IU/ml濃度下檢測到。

本研究建立的化學發光定量檢測試劑盒采用國際主流試劑通用的兩步法檢測，可以極大地降低HOOK效應。而且敏感度高，特異度好，各性能指標均可滿足臨床需求，擺脫了冗長的傳統手工操作。相對進口試劑價格便宜，有助于推動國產發光試劑在臨床上的大規模應用。根據上述結果，本研究得出結論，國產Hybiome HBsAg檢測試劑性能優良，適合臨床應用，完全可替代進口試劑。

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