基于同位素標記的相對和絕對定量的糖尿病并發肺結核患者血漿蛋白質組學研究

吳明歧 閆世春 劉玉琴 郭鑫 王美杰 田晶 侯紹英

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是肺結核(pulmonary tuberculosis，PTB)患病的重要危險因素[1]。DM可使PTB的患病風險增加1.5～7.8倍[2-3]，與此同時，糖尿病并發肺結核(DM-PTB)會增加PTB的治療難度，更易出現不良治療結局[4]。因此，在DM患者中早期診斷PTB，對于結核病的防控及后續的治療具有重要意義。然而，PTB的診斷方法仍有一定局限性，不利于疾病的早期診斷[5-6]。為此，深入探索DM-PTB的發病機制，識別特異性的生物分子用于PTB診斷尤為關鍵。蛋白質組學在篩選生物標志物，探尋疾病的發病機制方面得到了廣泛應用[7]。與傳統的雙向凝膠電泳結合質譜的方法相比，基于同位素標記的相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)蛋白質組學技術具有一致率高，標記過程簡單、反應迅速等特點，并且在檢測前排除血漿中大量高豐度蛋白的遮蔽作用，具有較好的檢測效能[8-9]。因此，筆者采用iTRAQ蛋白質組學技術，比較DM和DM-PTB患者的血漿蛋白質表達差異，篩選潛在蛋白生物標志物，為在DM患者中早期診斷PTB提供思路。

資料和方法

一、研究對象

采用回顧性研究的方法，選取2017年1月至2018年1月于黑龍江省傳染病防治院確診的DM患者(DM組)和具有DM病史且新診斷PTB的患者(DM-PTB組)作為研究對象。其中，DM組16例，DM-PTB組16例；所有研究對象均為漢族。DM診斷參照美國糖尿病協會制定的標準[10]，PTB診斷參照《WS 288—2008肺結核診斷標準》[11]。排除腫瘤、肝硬化等重病患者；乙型肝炎病毒和HIV感染者；妊娠和哺乳期女性；服用過抗結核藥物者。采用加入乙二胺四乙酸的抗凝采血管收集研究對象的清晨空腹靜脈血10 ml，4 ℃ 3000×g離心10 min，收集上清液于-80 ℃保存，以備后續分析。所有研究對象均經知情同意。

二、儀器與主要試劑

1.儀器：UltiMate3000型高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，Easy1200超高壓納升級液相色譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，Orbitrap Fusion Lumos質譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，高pH值反相色譜柱C181.7 μm，100 mm×4.6 mm(美國Phenomenex公司)，納升級分析柱Acclaim PepMap C181.9 μm，75 μm×250 mm(美國Dionex公司)。

2.主要試劑：尿素(美國Gibco BRL公司)，二硫素糖醇(美國Sigma-Aldrich公司)，碘乙酰胺(美國Sigma-Aldrich公司)，甲酸(美國Thermo Fisher Scientific公司)，乙腈(美國Thermo Fisher Scientific公司)，三乙基碳酸氫銨(美國Santa Cruz公司)，測序級胰蛋白酶(美國Promega公司)，三氟乙酸(美國Sigma-Aldrich公司)，碳酸氫銨(美國Sigma-Aldrich公司)，8標iTRAQ試劑盒(美國Applied Biosystems公司)，Top12高豐度蛋白去除試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)。

三、樣品處理

采用8標iTRAQ試劑對患者血漿樣品進行標記，將每組的樣品分別按隨機數字表排列，依次每4例血漿樣品混為1個樣品進行檢測，最終每組各得到4個混合樣品。使用Top12高豐度蛋白去除試劑盒對血漿樣品中的高豐度蛋白進行去除后，加入1.5 μg胰蛋白酶于37 ℃酶切12 h，對酶切后的樣品真空冷凍干燥以備后續使用。

用100 μl超純水溶解干燥的樣品。采用8標iTRAQ試劑在室溫條件下與樣品反應2 h，對肽段進行標記。待反應終止，將標記后的肽段樣品加入除鹽柱內除鹽，收集洗脫溶液并冷凍干燥備用。

四、液相色譜串聯質譜檢測

使用100 μl 10 mmol/L的碳酸氫銨水溶液溶解標記肽段，采用UltiMate3000型高效液相色譜儀和Easy1200超高壓納升級液相色譜儀進行分離。經液相色譜分離后的標記肽段采用Orbitrap Fusion Lumos質譜儀進行檢測，在正離子模式下采集信號，一級掃描范圍為350～1600 m/z。

五、統計學處理

將質譜數據導入到Proteome Discoverer 1.4軟件中進行數據處理，采用Mascot 2.3軟件進行搜庫，數據庫為Swiss-Prot數據庫。以DM-PTB組對DM組蛋白表達量變化倍數(fold change，FC)>1.2或<0.83且P<0.05為標準，篩選差異表達蛋白。采用RStudio 1.2軟件對差異表達蛋白進行基因本體(Gene Ontology, GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析，采用火山圖和層次聚類熱圖對差異蛋白表達情況進行可視化，以錯誤發現率(false discovery rate，FDR)<0.05為差異有統計學意義。

注 DM-PTB：糖尿病并發肺結核；DM：糖尿病圖2 糖尿病并發肺結核患者與糖尿病患者差異表達蛋白層次聚類熱圖

結 果

一、基本信息

DM-PTB組和DM組的年齡、性別分布、糖尿病病程、空腹血糖及胰島素使用情況差異均無統計學意義。DM-PTB組體質量指數明顯低于DM組，口服降糖藥者的比例明顯低于DM組，差異有統計學意義(表1)。

表1 不同特征在DM-PTB組和DM組研究對象中的分布情況

二、DM-PTB患者血漿差異表達蛋白鑒定

在兩組研究對象中共檢測到902個蛋白，篩選出DM-PTB組對DM組的差異表達蛋白有275個，其中在DM-PTB組中表達上調的蛋白有111個，在DM-PTB組中表達下調的蛋白有164個。采用火山圖對差異蛋白的篩選結果進行可視化，見圖1；采用層次聚類熱圖對差異蛋白的表達量及樣品的聚類情況進行可視化(圖2)，可見差異蛋白呈明顯聚類趨勢，DM-PTB組和DM組的樣品具有明顯的分組現象，說明各組內樣品一致性較好。

圖1 糖尿病并發肺結核患者與糖尿病患者差異表達蛋白篩選結果火山圖

在篩選出的275個差異表達蛋白中，進一步列出變化最為顯著的前20個蛋白，如表2所示，其中，在DM-PTB組患者血漿中表達上調和下調最明顯的蛋白分別是C反應蛋白和胸腺素β4。

表2 20個糖尿病并發肺結核患者與糖尿病患者顯著差異表達蛋白

續表2

三、差異表達蛋白的功能注釋

GO分析從細胞組成、分子功能和生物過程等3個方面對蛋白質進行注釋，進一步解釋差異蛋白的生物學功能。GO分析表明，275個差異表達蛋白分別富集了178條細胞組成術語、76條分子功能術語和865條生物過程術語(FDR<0.05)，其中，富集蛋白數目最多的前10條術語如表3所示。細胞組成中富集差異蛋白數目最多的是細胞器(87.27%，240/275)，此外差異蛋白還定位于細胞內(83.27%，229/275)、膜結合細胞器(83.27%，229/275)、細胞內組分(82.91%，228/275)和細胞質(81.45%，224/275)等部位。分子功能中富集差異蛋白數目最多的是結合(90.55%，249/275)，此外差異蛋白還具有蛋白結合(90.36%，225/249)、負離子結合(27.31%，68/249)、蛋白復合體結合(25.70%，64/249)和同一蛋白結合(25.30%，63/249)等功能。生物過程中富集差異蛋白數目最多的是細胞過程(92.00%，253/275)，此外差異表達蛋白還參與生物調節(80.73%，222/275)、生物過程調節(78.55%，216/275)、刺激反應(77.09%，212/275)和細胞過程調節(75.64%，208/275)等生物過程。

表3 差異表達蛋白的GO分析

四、差異蛋白的代謝通路分析

為了深入探索差異蛋白參與的代謝通路，利用KEGG數據庫對上述差異蛋白進行富集分析，結果表明，275個差異表達蛋白共富集到46條代謝通路，其中有統計學意義的通路有26條(FDR<0.05)，如表4所示。差異表達蛋白富集數目最多的通路為黏著斑通路(22個蛋白)。此外，差異蛋白還參與PI3K-Akt信號通路(17個蛋白)、血小板激活通路(14個蛋白)、吞噬體通路(11個蛋白)、膽固醇代謝通路(9個蛋白)和補體及凝血通路(8個蛋白)等與糖脂代謝和免疫相關的通路。

表4 差異表達蛋白的KEGG通路分析

討 論

DM-PTB的發病機制較為復雜，除感染結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)外，還與免疫、遺傳和代謝等多種因素有關[12-14]，因此，有必要采用系統生物學方法進行研究。Zhang等[15]比較了DM-PTB和PTB患者的血漿蛋白質表達差異，證實蛋白質組學在探索DM-PTB機制方面具有廣泛的應用潛力；然而，該研究的設計與本研究正好相反，且選用方法的檢測能力較低。為此，筆者采用iTRAQ蛋白質組學方法，對DM-PTB和DM患者的血漿進行研究，共篩選出275個差異表達的蛋白，為后續探討DM-PTB發病機制及早期診斷PTB提供依據。

年齡、性別及糖尿病病程與DM-PTB的發病密切相關[16]，因此，在人群招募時筆者對上述因素進行匹配，排除了混雜因素對結果的影響。兩組患者在降糖藥使用方面存在差異，可能是由于單純使用胰島素的DM患者血糖控制較差，易成為DM-PTB患者[17]，但兩組患者的空腹血糖水平相似，說明兩組患者是具有可比性的。此外，筆者還發現DM-PTB組患者的體質量指數低于DM組，推測原因是PTB作為一種消耗性疾病，易造成患者營養不良，從而引起能量的明顯缺乏[18]。

在筆者篩選出的顯著差異表達蛋白中，急性期蛋白如C反應蛋白、血清淀粉樣蛋白A2、α1酸性糖蛋白1、纖維蛋白原和甘露糖結合凝集素等在DM-PTB 組表達明顯上調，該類蛋白通常無明顯的組織特異性，在機體發生感染和炎癥時呈上升趨勢。富亮氨酸α-2糖蛋白1可通過調節體內轉化生長因子β通路參與炎癥過程，Garay-Baquero等[19]發現PTB患者血漿中富亮氨酸α-2糖蛋白1表達水平明顯高于健康對照組，提示該蛋白可能在PTB發生發展中起重要作用。本研究發現，DM-PTB患者血漿內上述參與炎癥過程的蛋白均明顯增高，說明與DM患者相比，DM-PTB患者體內的炎癥狀態明顯加重。胸腺肽β4是由胸腺組織分泌的具有生理活性的多肽，Kang等[20]發現PTB患者肺部肉芽腫組織內胸腺肽β4高表達，且該蛋白與低氧誘導因子1α和血管內皮生長因子介導的炎癥和血管再生有關。筆者研究發現，DM-PTB患者血漿中胸腺肽β4下調，可能與其被募集到肺部組織內有關。此外，筆者還發現鈣調蛋白、α-輔肌動蛋白1和β-parvin等與細胞自噬和結構變化有關的蛋白發生改變，這與MTB感染機體后引起細胞介導的免疫反應過程相適應。除上述蛋白外，筆者還發現了α/β水解酶結構域蛋白14B、ATP結合盒式亞族B成員9、神經顆粒素和轉凝蛋白2等差異蛋白。既往研究表明，這些蛋白與神經系統疾病和多種癌癥相關[21-24]，但對于其與DM-PTB的關系仍需進一步研究。

本研究通過GO分析對差異蛋白進行功能注釋，發現細胞器的差異蛋白富集度最高。細胞器可合成并分泌多種蛋白質，參與多項細胞功能。在細胞內的眾多細胞器中，溶酶體與細胞自噬、機體免疫防御和病原體清除密切相關，可通過與吞噬小體結合形成吞噬溶酶體，進一步殺死和降解病原體。MTB在侵襲巨噬細胞后，可抑制細胞內吞噬小體成熟或干擾吞噬溶酶體的形成，進而達到抑制細胞自噬，促進MTB在胞內存活的作用[25]。此外，筆者發現差異蛋白的分子功能與其參與的生物學過程相適應，主要通過結合的方式，參與包括細胞過程、生物調節、生物過程調節和刺激反應在內的多種生物學過程，提示上述生物學過程可能在DM-PTB發展過程中起著重要作用。

本研究對差異蛋白進行KEGG代謝通路分析后發現，黏著斑信號通路富集到的蛋白數目最多，提示該通路可能與DM-PTB發病密切相關。MTB感染機體后主要引起細胞免疫，黏著斑作為細胞與細胞外基質連接的主要方式，在維持細胞運動張力、促進細胞增殖和細胞生存信號傳遞方面發揮重要作用[26]。既往研究表明，DM和PTB患者體內差異表達分子均富集到了黏著斑通路，提示該通路可能與DM和PTB的發病相關[27-28]。與此同時，筆者發現差異表達蛋白還參與了PI3K-Akt信號通路、血小板激活通路、膽固醇代謝通路、吞噬體通路、補體及凝血通路等與糖脂代謝和免疫調節相關的信號通路。PI3K-Akt信號通路是黏著斑通路的下游通路之一，在葡萄糖轉運、調節蛋白質和脂肪代謝等方面發揮重要作用[29]。彭文光等[30]發現，活動性結核病患者外周血T淋巴細胞和Treg細胞的PI3K-Akt-mTOR通路各分子表達下調，提示該通路處于相對抑制狀態。由此可見，加強對PI3K-Akt信號通路內相關蛋白的研究可能有助于進一步揭示DM-PTB的發病機制。眾所周知，血小板在炎癥及免疫功能調節過程中發揮重要作用。Xu等[31]發現，DM-PTB患者的平均血小板體積高于PTB患者，但低于DM患者，提示血小板的形態變化可能與DM-PTB的發生有關。此外，DM患者免疫抑制和血脂代謝異常等狀態，增強了機體對MTB的易感性，進一步促進DM-PTB的發生發展[32]。

綜上所述，本研究從蛋白質組學的角度初步比較了DM和DM-PTB患者血漿蛋白質表達的差異，篩選出了可能與DM-PTB發病密切相關的蛋白，進一步發現DM-PTB患者體內與細胞活動、糖脂代謝和免疫調節相關的信號通路發生了顯著變化。下一步，作者將結合本研究鑒定到的蛋白和代謝通路繼續研究，深入發掘DM-PTB的發病機制，以期尋找特異性的蛋白標志物，實現對DM-PTB的早期識別和診斷。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突