實時熒光定量PCR檢測不同結(jié)核標(biāo)本及其聯(lián)合玻璃珠磨菌法檢測價值的初步研究

戴廣明 王芬 曹廷明 褚洪遷 黃海榮 孫照剛

結(jié)核病的快速診斷是結(jié)核病防控的重要措施之一，分子生物學(xué)方法是近年來獲得重要進展的結(jié)核病診斷方法[1]。其中，實時熒光定量PCR(qRT-PCR)是較為成熟的實驗室診斷技術(shù)，具有簡便快速、封閉擴增、重復(fù)性好、可實施定量檢測等優(yōu)點，已成為結(jié)核病診治的重要依據(jù)[2-3]。為進一步提高qRT-PCR檢測結(jié)核病的陽性率，促進該方法的合理利用，筆者對首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院2008—2016年間的qRT-PCR實驗室結(jié)核病診斷結(jié)果進行回顧性分析，并進一步探討玻璃珠研磨標(biāo)本處理對提高其陽性檢出率的效果。

材料和方法

一、研究材料

1．標(biāo)本來源：回顧性搜集2008年1月1日至2016年12月31日首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院住院和門診診治的疑似結(jié)核病患者11 570份樣本的qRT-PCR檢測結(jié)果(包括陽性份數(shù)及MTB-DNA數(shù)量)。其中，來自住院患者5348份、門診患者6222份；男性患者7037份、女性患者4533份；痰液1487份、膿液273份、腦脊液1391份、腹腔積液305份、氣管(支氣管)肺泡灌洗液41份、尿液147份、心包積液88份、胸腔積液3188份和血液4650份。

2．實驗菌株：結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)標(biāo)準(zhǔn)株(H37Rv，ATCC27294)由北京市結(jié)核病臨床數(shù)據(jù)和樣本資源庫提供。

3.用作磨菌處理的臨床痰液標(biāo)本：應(yīng)用計算機設(shè)立隨機種子建立偽隨機函數(shù)，選取5份含有經(jīng)金胺O染色法檢測為“+”菌量的痰標(biāo)本，用于驗證最佳磨菌時間；同樣方法另選取82份臨床診斷為肺結(jié)核的痰標(biāo)本，分別進行磨菌處理前后qRT-PCR檢測。

4．儀器和試劑：qRT-PCR檢測MTB的試劑由廣州達(dá)安基因股份有限公司提供，檢測靶標(biāo)為IS6110。擴增儀為杭州博日科技股份有限公司FGD-96A。

二、研究方法

1.標(biāo)本留取方法：痰液標(biāo)本留取滿足臨床操作規(guī)程[4]。囑患者晨起后漱口用力咳出氣管深處的第2口、第3口痰液于無菌帶蓋痰盒中，當(dāng)天送檢；膿液、腦脊液、胸腹腔積液、氣管(支氣管)肺泡灌洗液、心包積液和血液標(biāo)本由臨床醫(yī)生按照相關(guān)臨床操作規(guī)程完成留取[5]；尿液標(biāo)本需囑患者留取中段尿液于無菌試管中，用于后續(xù)的臨床檢測比較。

2.標(biāo)本DNA的提取：按照熒光定量PCR檢測試劑盒中的DNA提取說明書進行操作。(1)常規(guī)痰標(biāo)本處理：于痰液中加入4倍體積的4% NaOH溶液，搖勻，室溫放置30 min待液化；用槍頭或吸管混勻后吸取前期已均質(zhì)化液體1 ml加入1.5 ml離心管中，3000×g離心5 min；去上清，向沉淀物中加入滅菌生理鹽水1 ml，混勻，3000×g離心5 min；去上清，向沉淀物中加入50 μl DNA提取液，充分混勻，100 ℃恒溫處理(10±1) min，3000×g離心5 min，備用。(2)膿液、腦脊液、胸腹腔積液、氣管(支氣管)肺泡灌洗液、心包積液的處理：除無需前期的均質(zhì)化處理外，后續(xù)均與痰液處理一致。(3)血液標(biāo)本：血液標(biāo)本直接進行離心處理，收集血清后提取DNA。(4)MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv：將MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv接種于中性改良羅氏培養(yǎng)基上，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4周。再將培養(yǎng)后的菌株直接離心處理收集菌體，備用提取DNA。

3．qRT-PCR檢測DNA：將以上不同標(biāo)本的MTB-DNA提取液50 μl加入qRT-PCR檢測體系中，上機。反應(yīng)條件：93 ℃ 2 min預(yù)變性，93 ℃ 45 s，55 ℃ 60 s，10個循環(huán)；93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，30個循環(huán)。結(jié)果判定：痰MTB絕對數(shù)量介于102～103拷貝/ml時無法確定其是否為真陽性，故判定<103拷貝/ml為陰性，≥103拷貝/ml為結(jié)核感染陽性。但為了直觀菌株含量的不同數(shù)量級，本研究也對101拷貝/ml和102拷貝/ml的菌量進行統(tǒng)計。

4.玻璃珠研磨法聯(lián)合qRT-PCR檢測：(1)最佳磨菌時間的確定：選用培養(yǎng)后的MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv菌株。考慮磨菌時間過長會產(chǎn)熱多，可能引起核酸降解或DNA過碎，故研究通過qRT-PCR檢測(3次/組；1組/min)標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv在107拷貝/ml菌量數(shù)量級時不同磨菌時間(0、1、2、3、4、5和6 min)的濃度，以確定最佳磨菌時間。(2)最佳磨菌時間的驗證：研究通過建立偽隨機函數(shù)的方法選取5份金胺O染色涂片鏡檢結(jié)果為“+”的痰液標(biāo)品(液化處理后等分為7份)進行不同磨菌時間的處理(7份/組；1組/min)，通過qRT-PCR檢測菌株在107拷貝/ml菌量數(shù)量級時不同磨菌時間(0、1、2、3、4、5和6 min)的濃度。核實檢測濃度最高時的磨菌時間是否與標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的研磨最佳時間一致。(3)玻璃珠研磨處理后臨床痰標(biāo)本的qRT-PCR檢測：通過建立偽隨機函數(shù)的方法選取82份臨床診斷肺結(jié)核痰液標(biāo)本，每份標(biāo)本等分為兩份，一份直接行常規(guī)痰處理獲得qRT-PCR結(jié)果(同前文)；另一份磨菌處理后再進行qRT-PCR檢測，具體操作為：將痰標(biāo)本進行4% NaOH溶液均質(zhì)化處理，離心收集沉淀，加入TE緩沖液(由Tris和EDTA配制而成)洗滌1次，最后轉(zhuǎn)移至含有0.3 mm直徑玻璃粉的離心管中，加入熒光定量PCR試劑盒中的DNA提取液，在渦旋振蕩器上以最大速度(2800 r/min)振蕩5 min，提取MTB-DNA。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、不同臨床標(biāo)本qRT-PCR檢測結(jié)果

11 570份臨床標(biāo)本的qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，氣管(支氣管)灌洗液的檢出率最高(36.59%)，以門診患者來源的陽性率最高(43.48%)；其次是膿液標(biāo)本，總陽性檢出率為35.53%，以住院患者來源的陽性率最高(36.26%)；痰標(biāo)本的總陽性率居第三位。其他標(biāo)本的陽性檢出率均低于20%，其中住院患者尿液的陽性率僅為18.42%，門診患者的腦脊液標(biāo)本陽性率也僅有15.95%，而門診患者的腹腔積液和尿液標(biāo)本陽性率最低(均為7.04%)。具體見表1。

表1 11 570份不同臨床標(biāo)本的qRT-PCR檢測情況

二、不同標(biāo)本中的MTB菌含量

結(jié)果顯示，膿液、痰液和灌洗液中所含菌量≥103拷貝/ml菌株數(shù)量的標(biāo)本比例分別為35.53%(97/273)、30.33%(451/1487)和36.59%(15/41)，具體見表2。

表2 不同臨床標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌絕對定量結(jié)果分布

三、最佳磨菌時間的確定

對標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv進行研磨(3次/組；1組/min)，5 min組的qRT-PCR檢測濃度最高[(5.22±1.32)×107拷貝/ml]。對選取的5份金胺O染色涂片結(jié)果為“+”的痰液標(biāo)品(液化處理后等分為7份)在不同磨菌處理時間點經(jīng)研磨處理后(7份/組；1組/min)行qRT-PCR檢測，5 min組的檢測濃度最高[3.87(2.94，5.09)×103拷貝/ml]，提升效果最好。確定振蕩研磨5 min為磨菌最優(yōu)時間。具體見表3。

表3 H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株和涂片“+”痰液標(biāo)本經(jīng)振蕩研磨處理后不同時間的檢測情況

四、磨菌前后定量檢測結(jié)果

選取的82份痰標(biāo)本在進行5 min的磨菌處理后，核酸檢測濃度的提高較處理前的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=2.120，P=0.016)。其中，有28份(34.15%)痰標(biāo)本提高了菌量數(shù)量級，陽性檢出率也由磨菌處理前的60.98%(50/82)提高到處理后的78.05%(64/82)，這是因為21例含菌量為102拷貝/ml數(shù)量級的臨床痰標(biāo)本經(jīng)振蕩研磨后有14份(66.67%)的菌量提升到了103拷貝/ml菌株數(shù)量級，提升了痰菌陽性率，并與臨床診斷結(jié)果一致。其他菌量雖在磨菌后的檢出率有所提升，但沒有改變檢測結(jié)果的性質(zhì)。具體見表4。

表4 82份臨床痰液標(biāo)本磨菌提取法處理前后的不同痰菌數(shù)量級檢出情況

討 論

近年來，大量的臨床實踐證明qRT-PCR檢測技術(shù)以其靈敏、特異、快速、操作簡便的優(yōu)勢廣泛應(yīng)用于結(jié)核病診斷領(lǐng)域，對快速發(fā)現(xiàn)和診斷結(jié)核病具有重要價值。2021年初，世界衛(wèi)生組織對三類核酸擴增檢測技術(shù)的應(yīng)用進行了系統(tǒng)綜述并發(fā)布了更新的關(guān)于使用核酸擴增技術(shù)檢測結(jié)核病以及耐藥結(jié)核病的快速通告[6]，新的建議將在2021年更新的世界衛(wèi)生組織結(jié)核病整合指南的模塊3：診斷-結(jié)核病快速診斷檢測中給出詳細(xì)解讀。這些措施都突顯出核酸檢測的重要價值。因此，總結(jié)現(xiàn)有qRT-PCR方法在結(jié)核病核酸檢測的臨床效果，對發(fā)現(xiàn)和提高其臨床應(yīng)用效果具有積極意義。

由于MTB細(xì)胞壁堅固，普通試劑難以進入，使得核內(nèi)MTB核酸中的鳥嘌呤G和胞嘧啶C在所有堿基中的占比(GC含量)較高，但擴增效率較低。因此，盡管qRT-PCR實驗操作簡便，但在操作過程中因人為操作失誤或樣本質(zhì)量等問題導(dǎo)致的“錯誤”“無效”“無結(jié)果”等異常情況時有出現(xiàn)[7]，在縣(區(qū))級結(jié)核病防治機構(gòu)實驗室檢查中出現(xiàn)的頻率可達(dá)10%以上[8]，對臨床標(biāo)本及檢測試劑盒造成浪費，并延誤患者診治。本研究經(jīng)qRT-PCR檢測11 570份疑似結(jié)核病患者樣本的最高陽性檢出率來源于氣管(支氣管)灌洗液門診標(biāo)本(43.48%)，明顯高于唐婧等[9](27.87%)和鄒自英等[10](31.71%)報道；其次為膿液(35.53%)，明顯低于鄒自英等[10](48.84%)報道；再次為痰液標(biāo)本(30.33%)，基本與鄒自英等[10](30.39%)報道相一致，但低于梁建琴等[11](36.75%)報道；而其他標(biāo)本的陽性率均低于20%。分析其原因可能與患者病情輕重、醫(yī)師臨床診斷水平和主觀推薦qRT-PCR檢測意愿，以及MTB-DNA提取效率等因素有關(guān)。在對不同臨床標(biāo)本中MTB絕對定量分布結(jié)果中可以看出，如果核酸的提取效率獲得提高，則介于102拷貝/ml和103拷貝/ml菌量之間的部分標(biāo)本可以達(dá)到診斷陽性的標(biāo)準(zhǔn)，且陽性結(jié)果與最終臨床綜合診斷一致。

提高qRT-PCR檢測陽性率的措施有多種，包括磁珠法、濾膜法等，但是最根本的辦法是通過提高菌體的破碎效果，以利于核酸的提取[12-13]。由于菌量為“+”的涂片標(biāo)本，其每毫升中的含菌量較低，約有數(shù)千條，加之其痰菌DNA的提取易受雜質(zhì)含量和痰液類型等因素的影響，推斷其菌量和定量PCR結(jié)果之間的線性關(guān)系較為困難，故為了解玻璃珠磨菌法對提高qRT-PCR檢測結(jié)核病臨床標(biāo)本陽性率的效果，本研究選取涂片結(jié)果為“+”的臨床標(biāo)本進行磨菌效果分析，但由于檢測條件所限，研究僅通過82份臨床痰標(biāo)本對振蕩磨菌優(yōu)化處理的方法有效性進行了驗證探索，證實了痰標(biāo)本經(jīng)振蕩磨菌處理后可明顯提高痰標(biāo)本的檢出菌量，且以含有數(shù)量級102拷貝/ml菌量的標(biāo)本提高效果最為明顯。提示提高含有102拷貝/ml菌量數(shù)量級標(biāo)本的核酸提取方法對于提高qRT-PCR檢測陽性率具有重要意義。但對于結(jié)論的推廣尚需較大樣本量的臨床驗證。

志謝感謝首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院疾控處康萬里老師對統(tǒng)計學(xué)方法給予的悉心指導(dǎo)