牛貝消核提取物血清藥物化學的初步研究

段利瑤 凌彥博 梁艷 史迎昌 王蘭 趙冠人 劉軍 鄭越 吳雪瓊

中醫經驗方牛貝消核在臨床上已應用長達16年，由川貝母(Bulbus Fritillariae Cirrhosae)、白及(Rhizoma Bletillae)、魚腥草(Herba Houttuyniae)、桔梗(Radix Platycodonis)、牛蒡子(Fructus Arctii)和糯米(Glutinous rice)6味中藥組成。其中，川貝母和白及為君藥，川貝母具有潤肺止咳，清熱化痰的功效，主治虛勞久咳、肺熱燥咳和咯痰帶血等癥[1]，白及具有抗菌、止血、抗纖維化和抗氧化等多種藥理作用[2]；魚腥草、桔梗和牛蒡子為臣藥，魚腥草多用于肺癰吐膿、癰腫瘡毒和痰熱喘咳等，桔梗宣肺、利咽、祛痰和排膿，牛蒡子有宣肺透疹、解毒利咽和疏散風熱的功效[3]；益肺氣、健脾胃的糯米為佐使藥。因此，本方6味中藥配伍合理，具有軟堅化結、清熱解毒、止咳化痰和滋陰潤肺的功效，能夠消除咳嗽、胸痛、低熱、咯血和消瘦等結核病癥狀。

中醫藥文化是中華民族傳統文化的精髓，具有廣闊的發展前景。然而中藥成分復雜，每味中藥都含有數十種甚至上百種成分，而其在體內的效應大多是多種成分協同作用的結果。中藥傳統的口服給藥形式決定了只有被吸收進入體內的物質才能產生活性，且吸收進入體內發揮作用的并非一定是原形成分，也可能是其代謝產物[4]。中藥血清藥物化學是以中藥口服給藥后血清為樣品，應用藥物化學的研究方法，聯合多種現代化技術，從血清中分離、鑒定移行成分，研究血清中移行成分與傳統療效的相關性，闡明體內直接作用物質代謝及體內動態變化的領域[5]。目前，中藥血清藥物化學得到廣泛應用，為中藥的研究提供了一種新的研究思路，有利地推動了中藥的發展。本研究應用高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography, HPLC)初步研究牛貝消核提取物的主要有效成分在血液中的移行變化，確定牛貝消核作用的主要入血藥效成分，試圖闡明其在動物體內移行成分與傳統療效的相關性，為其體內直接作用物質代謝及體內動態規律研究奠定基礎。

材料和方法

一、實驗材料

1. 實驗儀器：高效液相色譜儀(DGU-20A3prominence DEGASSER，配二元梯度泵、自動進樣器)； Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)；KQ-300GVDV型三頻恒溫數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；QL-901型旋蝸混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；高速冷凍離心機(Centrifuge 5418，Eppendorf)。

2. 藥品與試劑: (1)牛貝消核提取物：牛貝消核提取物干浸膏粉委托西安新通藥物研究有限公司生產，批號為180901；(2)乙腈：色譜純，美國賽默飛世爾科技有限公司；(3)甲醇：色譜純，美國賽默飛世爾科技有限公司；(4)牛蒡苷(Arctiin)標準品：中國食品藥品檢定研究院，批號110819-201711；(5)白及標準品：批號BWB51613，中國世紀奧科生物技術有限公司；(6)牛蒡子標準品：批號120903-201710，中國世紀奧科生物技術有限公司；(7)桔梗標準品：批號121028-201712，中國世紀奧科生物技術有限公司；(8)魚腥草標準品：批號BWB51804，中國世紀奧科生物技術有限公司。

3. 實驗動物:清潔級BALB/c雌性小鼠55只，6～8周齡，體質量19～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號SCXK(京)2016～0006]。

二、方法

1. 體外供試品溶液的制備:稱取牛貝消核提取物1.00 g，溶于40 ml蒸餾水，混勻，99 ℃加熱1 h助溶，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，作為體外供試品溶液；稱取牛蒡子、桔梗、魚腥草、白及標準品及牛蒡苷標準品10 mg分別溶于600 μl甲醇，渦旋混勻，置離心半徑為8.9 cm的離心機，于13 000 r/min離心10 min，取上清。

2. 空白及含藥血清樣品的制備：55只小鼠按照數字表法隨機分為11組，灌胃給藥體積為 0.2 ml/10 g。1～5組為牛貝消核提取物組，每只小鼠每天給予 1.25 mg/g牛貝消核提取物，連續灌胃給藥7 d；6～10組為牛蒡苷組，每只小鼠每天給予 0.3 mg/g牛蒡苷，連續灌胃給藥7 d；11組為空白對照組，給予蒸餾水灌胃，連續灌胃7 d。每組小鼠于末次灌胃給藥后0.5、1、2、4、6 h小鼠眼眶后靜脈叢取血，血樣置離心半徑16.7 cm的離心機，于3000 r/min 離心10 min，吸取上清液；上清液200 μl加入乙腈400 μl(1∶2)，渦旋混勻，置離心半徑為8.9 cm的離心機，于13 000 r/min離心10 min，取上清，作為血清供試品溶液。

3. 色譜條件: 2018年4月至2019年6月在中國人民解放軍總醫院第八醫學中心全軍結核病研究所采用高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography, HPLC)分析，采用色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)，紫外檢測器檢測波長210 nm，流速1.0 ml/min，最大進樣體積為100 μl，流動相為水(A)～80%乙腈(B)，梯度洗脫程序：0～30 min，流動相A比例由100.0%降至0，流動相B比例由0增至100.0%；30～35 min，流動相A比例由0增至100.0%，流動相B比例由100.0%降至0。

4. 牛貝消核提取物及其血清中成分分析：取牛貝消核提取物溶液，以及含藥血清樣品在相同的色譜條件下進行 HPLC分析，建立其指紋圖譜，并比較分析確定入血成分。然后參照對照品初步鑒定牛貝消核提取物的入血成分。

結 果

一、 牛貝消核提取物的HPLC分析結果

牛貝消核提取物的HPLC圖見圖1，與牛蒡子、桔梗、魚腥草、白及標準品圖譜比較，在同一色譜條件下，發現峰1保留時間為7.1 min，峰2保留時間為13.5 min，峰3保留時間為15.5 min，峰4保留時間為16.3 min，峰5保留時間為21.2 min。同時，牛蒡苷保留時間為16.3 min(圖2)。

注 a：牛蒡子，b：桔梗，c：牛貝消核提取物，d：魚腥草，e：白及；牛貝消核提取物(c)中峰1對應的物質來源于桔梗(b)，峰2、3、5對應的物質來源于白及(e)，峰4對應的物質來源于牛蒡子(a)圖1 牛貝消核提取物與藥材標準品HPLC圖

注 a：牛貝消核提取物，b：牛蒡苷圖2 牛貝消核提取物和牛蒡苷標準品HPLC圖

二、 牛貝消核含藥血清樣本HPLC分析結果

牛蒡苷標準品體外樣品色譜圖顯示牛蒡苷保留時間為16.3 min，牛蒡苷灌胃給藥后并未明顯檢測出牛蒡苷成分，但灌胃給藥后0.5、1、2、4、6 h血清與空白血清色譜圖比較，圖譜中清晰可見17.5～22.5 min有吸收峰，且隨時間的變化而改變，2 h達吸收最高峰，4 h開始下降。同時牛貝消核灌胃后在此時間段也出現相同特征的吸收峰，且0.5 h的吸收峰最高，1 h開始下降。詳見圖3、4。

注 a：牛蒡苷標準品，b～f：牛蒡苷灌胃后0.5、1、2、4、6 h圖3 牛蒡苷標準品小鼠血清藥物化學分析HPLC圖

注 a：空白血清，b～f：牛貝消核提取物灌胃后0.5、1、2、4、6 h圖4 牛貝消核提取物小鼠血清藥物化學分析HPLC圖

討 論

目前，絕大部分中藥及復方只能采用口服方式給藥，口服中藥后的血清中含有真正的有效成分，即原形成分、代謝產物、機體產生的生理活性物質[6]。因此，通過分析口服給藥后血清中成分，確定中藥及復方在體內的直接作用物質，將成為準確、快速的確定中藥藥效物質基礎的有效途徑。

通過牛貝消核提取物與藥材標準品HPLC圖比較發現，峰1來源于桔梗，峰2、3、5來源于白及，峰4來源于牛蒡子，并在牛貝消核提取物中鑒定出牛蒡苷化合物，表明通過HPLC分析可作為牛貝消核提取物中桔梗、白及、魚腥草和牛蒡子提取的質量控制方法。其中桔梗具有宣肺、利咽、祛痰和排膿等多種藥理作用，白及具有抗菌、止血、抗纖維化和抗氧化的作用[2]，牛蒡子有宣肺透疹、解毒利咽和疏散風熱的功效，并且牛蒡苷是牛蒡子的主要活性成分，具有較強的抗炎及免疫調節活性、抗病毒活性[3]。結合各味中藥藥理活性及研究數據，推斷牛貝消核所發揮藥效的物質分別來源于桔梗、白及和牛蒡子中主要的活性物質，并選用牛蒡苷為對照進行牛貝消核血清藥物化學的初步研究。

樣品預處理是為了分離基質和共存的干擾物質，富集待測成分，純化樣品，提高檢測敏感度。血漿、血清等生物樣品中的主要干擾物質為氨基酸、蛋白質、磷脂和多肽等。在色譜分離中，這些干擾物質產生的雜質峰有可能會與待測成分產生的色譜峰重疊，從而干擾實驗的準確性。生物樣品處理的方法主要包括：蛋白沉淀法、固相萃取法、液液萃取法等[7]。蛋白沉淀法是在樣品中加入有機溶劑(甲醇、乙腈、丙酮等)、有機酸、重金屬鹽等將蛋白沉淀，純化樣品血樣與有機試劑體積比一般為1∶1～1∶4時，可將97%以上的蛋白除去[8]，Chen等[9]應用甲醇/乙腈混合溶液沉淀蛋白以純化血樣，對黃芪顆粒藥效學與血清藥物化學質量評估進行研究。Zhang等[10]則采用甲酸來沉淀蛋白對三子固本顆粒質量評估進行研究。He等[11]用乙腈直接沉淀蛋白后對牛蒡子苷的體內吸收藥代動力學進行研究。王宇卿等[12]的研究顯示乙腈沉淀法得到的樣品色譜圖信息量較大，干擾少。根據以上研究，筆者采用乙腈沉淀蛋白的方法進行預處理。

參考胥秀英等[13]的研究，本研究采用了足夠劑量的牛蒡苷灌胃。牛蒡苷HPLC體內分析結果提示并未明顯檢測出牛蒡苷成分，但發現2個高低不同的吸收峰，而牛貝消核提取物灌胃后也檢測出與牛蒡苷相似的2個吸收峰，推測可能檢測出牛蒡苷的代謝產物。Wang等[14]對口服牛蒡苷的藥代動力學研究表明，牛蒡苷在口服后快速吸收，隨后迅速消失。鄭一敏等[15]報道，牛蒡苷在動物體內代謝變化快速、受雜質干擾小，穩定性和重現性較好，且牛蒡苷在體內吸收很快，消除也快。牛蒡苷的代謝產物有牛蒡子苷元、(-)-腸內酯、(-)-牛蒡子苷、[(2R, 3R)-2-(3′-羥基苯甲基)-3-(3″,4″-二甲氧基苯甲基)-丁內酯[14,16]。本研究還需進一步研究確定這些吸收峰是否為牛蒡苷的代謝產物，是什么代謝產物，是否可作為牛貝消核體內血藥濃度檢測的標志物。牛貝消核體內分析只明顯檢測出與牛蒡苷代謝產物相同特征的吸收峰，并未明顯檢測出其他吸收峰，可能是由于中藥化學組分復雜，有效成分含量較低，生物利用度低。由于牛貝消核體外HPLC結果顯示可以明確檢測出牛蒡苷成分，因此本研究暫時只選用牛蒡苷作為對照，通過后續實驗條件及設備的不斷改善，今后實驗中會選擇更多有效成分作為對照。

本研究首次運用HPLC對牛貝消核提取物的血清藥物化學進行研究，結果提示牛貝消核提取物入血藥效成分微量，血中移行成分推測為牛蒡苷代謝產物。后續研究需進一步優化實驗方案及實驗設施，為牛貝消核體內直接作用物質代謝及體內動態規律研究奠定基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突