近紅外二區熒光探針的設計及應用研究進展

黃艷芳，李子婧

(廈門大學公共衛生學院，分子影像暨轉化醫學研究中心，福建 廈門 361102)

光學成像技術具有無創、安全、可視化能力強、空間分辨率高、成本低等優點，可對生物分子、細胞、組織和生物體進行實時、多維的可視化監測，是生物醫學領域中的重要研究手段[1-2].熒光成像由于其靈敏度高、分辨率高及操作簡單等優點，在生物分子檢測成像、藥物分布代謝跟蹤、疾病檢測和診斷，特別是癌癥早期診斷和影像引導治療中，具有良好應用前景.

與可見光相比，發射波長在近紅外區域的熒光探針可獲得更深的穿透深度和更好的成像質量，因此，近10年來，熒光成像技術主要集中在近紅外窗口.近紅外一區(NIR-Ⅰ，700～900 nm)熒光成像以其高靈敏度、快速反饋、無危害輻射、低成本等優點，在生物醫學研究中受到廣泛關注.例如，利用NIR-Ⅰ熒光染料可以精確地描繪前哨淋巴結/腫瘤輪廓，并在術中引導切除前哨淋巴結/腫瘤組織[3].最近的研究表明，由于具有散射少、組織吸收可忽略和自熒光效應最小化等優勢，在近紅外二區(NIR-Ⅱ，1 000～1 700 nm)進行生物醫學成像可以充分提高成像的時空分辨率(約20 ms 和約25 mm)以及穿透深度(高達3 cm)，從而獲得比NIR-Ⅰ更好的圖像質量和更高的信背比[4-7].

目前，臨床批準的近紅外熒光染料有兩種，分別是吲哚菁綠(ICG，發射波長800 nm)和亞甲基藍(MB，發射波長700 nm)，兩者都是可以快速排泄的小分子，主要用于NIR-Ⅰ成像[2].隨著化學合成的不斷發展，新的熒光材料不斷被發掘.NIR-Ⅱ熒光材料種類也日益豐富，如有機熒光材料、量子點、稀土納米材料等被開發應用于近紅外生物醫學成像.然而，缺乏良好的水溶性、穩定性、熒光效率和生物相容性等是NIR-Ⅱ熒光材料發展的瓶頸.如何解決這些問題是NIR-Ⅱ熒光成像領域的熱點，也是未來發展方向[8-12].因此，開發熒光效率高、水溶性好、生物相容性好的新型NIR-Ⅱ熒光材料，對熒光成像技術的發展具有重要意義.本文對近期新型NIR-Ⅱ熒光材料的設計理念及其在生物醫學領域的應用進行綜述和展望，以期為NIR-Ⅱ熒光成像技術的發展提供參考思路.

1 有機NIR-Ⅱ熒光探針

目前，已經開發出多種性能優良的有機NIR-Ⅱ熒光材料，其具有明確的化學結構，并且易于代謝，生物相容性好[13]，因此極具吸引力和發展前景，有望率先在未來的臨床中應用.

1.1 苯并雙噻二唑(BBTD)類

具有供體-受體-供體(D-A-D)特征的熒光團，如BBTD衍生物，具有較大的斯托克斯位移(約200 nm)和高成像質量.在D-A-D支架中，強電子供體與中心電子受體的空間結構可縮小雜化最高占據分子軌道(HOMO)與最低未占據分子軌道(LUMO)能級之間的能隙，將熒光發射波長紅移至NIR-Ⅱ窗口[13-16].BBTD通過調節D-A-D熒光團的受體和供體結構可以有效地改變吸收和發射光譜特征.

通常，BBTD基熒光團的最大吸收波長和發射波長分別位于800和1 000 nm左右，波長相對較短.設計波長更長的新型熒光團將有利于在NIR-Ⅱ對深層組織進行成像[17].Fang等[18]研究后發現：用Se原子取代BBTD骨架中的S原子可以使發射波長紅移，引入給電子氨基也可以使發射波長延長至NIR-Ⅰ；但是單一的改進措施只能使波長紅移≤50 nm，如何進一步有效延長波長仍然是一項挑戰.通過同時在BBTD骨架中引入一個Se原子和一個氨基，開發了一種最大發射波長為1 210 nm的新型有機小分子熒光團FM1210；與S取代的類似物CF1065相比，FM1210的發射波長大幅紅移了145 nm，并保持相當的量子產率和亮度，從而使FM1210的活體成像質量明顯高于CF1065，波長增益約為使用單一修飾的BBTD衍生物(約50 nm)的3倍，超過1 200 nm區域波長的大幅增加可歸因于Se原子和氨基的協同作用.這些優點進一步使NIR-Ⅱ熒光探針能夠以100幀/s的速度對小鼠進行成像.此外，該研究還證明納米尺度的FM1210脂質體(FM1210-NPs)能以高信背比對腫瘤及血管系統進行活體成像(圖1).

圖1 FM1210的結構(a)及其脂質體用于血管及腫瘤的熒光成像(b)[18]

揭示BBTD基熒光團的分子結構與光學行為之間的關系，也有助于開發具有長波長熒光發射的探針.為此，Ye等[19]研究了BBTD核心兩側的共軛橋和電子供體對光學行為的影響：當將苯基噻吩共軛橋(如PT、PPT和PTT)置于BBTD核心兩側時，它們的吸收波長在640～860 nm區域，而其發射波長約1 070 nm；當加入噻吩橋(TPAT)時，吸收和發射波長分別可達920和1 150 nm.在芴吡咯(FP)官能團存在的情況下，由于吡咯的NH基團與BBTD的氮原子之間形成了分子內氫鍵，吸收波長可達1 020 nm，發射波長超過1 200 nm.這些結果表明，TPAT和電子供體是延長熒光團吸收和發射波長的關鍵成分.基于此，選擇TPAT和苯乙烯來放大共軛橋，以N，N-二甲基氨基作為電子供體，將它們整合到BBTD支架中，從而得到在942 nm處有一個很強的吸收峰、在1 302 nm處有一個發射峰的目標分子BBTD-1302.1 302 nm 處的最大發射峰不僅有助于解決更深層腫瘤的成像問題，還避免了使用長通濾波器時熒光成像的亮度下降[13].接著以聚乙二醇(PEG)化表面活性劑對其進行功能化形成水分散性納米粒子BBTD-1302NPs，并通過體外研究驗證了BBTD-1302NPs的高生物相容性和耐光降解性；基于BBTD-1302NPs的良好性能，在荷瘤裸鼠體內對BBTD-1302NPs的光熱治療能力進行了研究，結果顯示經尾靜脈注射BBTD-1302NPs和980 nm激光照射的小鼠腫瘤生長受到抑制.

為了改善NIR-Ⅱ熒光量子產率，目前還開發出多種具有屏蔽單元-供體-受體-供體-屏蔽單元(S-D-A-D-S)結構的熒光團.引入屏蔽單元可以保護熒光團的共軛骨架免受分子間相互作用，從而提高量子產率；同時，供體單元也有助于改善S-D-A-D-S熒光團在水溶液中的量子產率性能.例如：使用3，4-乙二氧基噻吩(EDOT)代替噻吩作為供體單元，可以使熒光探針水溶液中的量子產率從0.002%指數級增加到0.2%(將熒光團IR-26在二氯乙烷中的量子產率0.05%作為參比測定得出)；具有增強疏水性的3-辛基噻吩進一步作為熒光團IR-FTAP的第一供體，在水中的量子產率提高到0.53%[20].盡管這種供體修飾可有效改善水溶液中的量子產率，但也會引起共軛主鏈更大的畸變，從而導致吸收光譜移動，發射波長減小，吸收系數降低.因此，為有效改善熒光團的亮度，在提高量子產率的同時應不犧牲吸收系數.基于此，Ma等[21]設計并合成了以二辛基鏈取代的3，4-丙基二氧基噻吩(PDOT)為供體單元的新型S-D-A-D-S NIR-Ⅱ熒光團IR-FP8P，以增強量子產率和吸收系數；與IR-FTAP的3-辛基噻吩相比，PDOT供體的共軛主鏈扭曲較小，因此IR-FP8P實現了吸收光譜的紅移和吸收系數的提高.此外，二辛基鏈取代的PDOT能很好地保護主鏈不與水相互作用，量子產率明顯提高.結果顯示：IR-FP8P在水溶液中的熒光量子產率為0.60%，在水溶液中的峰值吸收系數為1.3×104L/(mol·cm);與IR-FTAP相比，亮度(808 nm激發)增加了5.7倍以上.IR-FP8P可在1 300 nm長通濾波器下對小鼠后肢血管進行成像，并觀察到清晰的血管網絡，信背比約為7.此外，通過偶聯卵泡刺激素(FSH)制備具有靶向能力的FSH@FP8熒光探針，可用于小鼠卵巢成像.

大多熒光分子探針在聚集態時，會由于平面結構分子間強π-π相互作用誘導熒光猝滅(ACQ)效應，在水溶液或生理條件下熒光亮度降低，從而限制了其生物成像質量.Mei等[22]和Liu等[23]發現了與ACQ相反的聚集誘導發光(AIE)現象，即處于聚集狀態的熒光探針強度遠高于分散態.因此，當賦予NIR-Ⅱ熒光材料AIE特性，它將具有更高的熒光效率和光穩定性，同時大幅提升成像清晰度和分辨率.近期，Li等[24]以BBTD為電子受體、三苯胺(TPA)為電子供體，利用AIE活性分子轉子，設計并合成了PEG化SA-TTB-PEG100；通過自組裝技術獲取了納米顆粒(粒徑為35 nm)，在約1 050 nm處表現出最大熒光發射峰，在水中的最高量子產率為10.30%.此外，該自組裝的納米顆粒相比于通過兩親性聚合物包裹的對應物，表現出更小的多分散指數(PDI)、更好的均一性以及更久的膠體穩定性，在生物成像方面具有更好的潛力.接著，利用此納米探針在小鼠和兔模型中評估了這種AIE納米顆粒的近紅外熒光成像性能，結果顯示，NIR-Ⅱ熒光成像在體分辨率約38 μm，穿透深度約1 cm.該研究表明，高效自組裝策略設計的NIR-Ⅱ AIE納米顆粒對血管相關疾病的診斷和治療具有重要意義，為NIR-Ⅱ熒光成像技術的轉化應用提供了新機會.

1.2 花菁類

基于聚次甲基骨架的花菁染料含有擴展π共軛體系，具有獨特的共軛骨架結構.通過加長聚次甲基鏈、增加雜環供體強度，或將雜原子從氧改變為其他硫族元素等方法，可以使染料的吸收波長紅移.與D-A-D型染料相比，花菁類染料合成過程相對簡單，吸收強度較高(ε>105L/(mol·cm))，特別是對近紅外光有很強的吸收，因此很適合于近紅外成像[25-26].

由于循環時間短，菁類染料為血管成像提供的成像時間窗口通常小于2 min.將染料與蛋白質進行生物結合可以增強循環時間，但這可能會產生猝滅效應而犧牲亮度.因此，需要發展一種新策略，在改善藥代動力學特征的同時，又能確保NIR-Ⅱ熒光團的高量子產率.Tian等[27]通過牛血清白蛋白(BSA)和花菁染料之間的工程化超分子組裝，開發了一個自組裝的、尺寸約為50 nm的IR-783@BSA.該復合物可以保持扭曲的構象，且IR-783與白蛋白之間的納摩爾級結合親和力增強了扭曲的分子內電荷轉移(TICT)過程和循環時間；循環時間增強使IR-783@BSA能夠在注射后3 h內觀測到3 μm寬的血管，同時具有超高的對比度，從而獲得高質量的NIR-Ⅱ成像.

目前，NIR-Ⅱ花菁類染料在生物成像中存在穩定性差、斯托克斯位移小，或發生溶劑化猝滅等缺點.針對這些問題，Ren等[28]通過理性設計和理論計算相結合，提出構建NIR-Ⅱ熒光染料的新思路，即增大空間位阻和電子不對稱性，并以此開發了一系列穩定、高量子產率、抗溶劑化猝滅的新型菁熒光團(NIRⅡ-RTs)，其在水溶液中的吸收和發射峰分別高達977和1 008 nm.與傳統的NIR-Ⅱ七甲川菁相比，NIRⅡ-RTs具有較小的斯托克斯位移和對溶劑極性敏感的吸收帶，在極性溶劑中表現出穩定且強烈的吸收.穩定性測試表明，NIRⅡ-RTs在生理環境中的化學穩定性和光穩定性均優于商用七甲川菁類似物IR1061和吲哚菁綠.這些特點使NIRⅡ-RTs在生物成像應用中具有優異的高亮度和深層組織穿透性.此外，由于引入了羧酸官能團，新型染料NIRⅡ-RT3/4可以通過螺旋環化作用產生一個強大的熒光開關機制，所以NIRⅡ-RT染料可以設計作為可激活的NIR-Ⅱ熒光探針.作為概念的證明，該團隊應用NIRⅡ-RT4構建了一系列可靶向激活的NIR-Ⅱ熒光探針(NIRⅡ-RT-pH、NIRⅡ-RT-三磷酸腺苷(ATP)和NIRⅡ-RT-Hg)，用于生物相關物質的檢測.特別是利用NIRⅡ-RT-ATP探針，首次實現了高對比度藥物性肝損傷小鼠肝臟ATP含量的實時監測.

通常，有機熒光染料僅通過結構修飾很難將最大吸收波長和發射波長紅移至1 300 nm以上，而J-聚集體可以使單個分子的吸收和發射波長紅移，吸收系數增強且斯托克斯位移減小.因此，為了獲取更長吸收和發射波長的NIR-Ⅱ探針，最近Sun等[29]通過自組裝FD-1080花菁染料和1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DMPC)，成功開發了一種新型的NIR-Ⅱ探針FD-1080 J-聚集體，其在生理條件下表現出較高的親水性和穩定性，最大吸收和發射波長均超過1 300 nm；進一步利用分子動力學模擬研究了磷脂DMPC與FD-1080在J-聚集體形成過程中的相互作用；此外，還對FD-1080 J-聚集體進行了1 500 nm以上的光學成像(圖2)，并成功用于監測高血壓大鼠在給藥后頸動脈的動態變化，以評價降壓藥的療效.

圖2 浸沒于不同深度甘油中的J-聚集體的熒光圖像(a)，不同成像窗口中在穿透深度處J-聚集體的半峰寬(FWHM)(b)及注射J-聚集體后在不同區域獲得的腦和后肢血管圖像(c)[29]

1.3 硼二吡咯烷(BODIPY)類

BODIPY染料具有高的量子產率、優異的化學和光物理穩定性，在分子成像和藥物傳遞方面發揮著重要作用[30-31].經典的BODIPY吸收范圍為500～600 nm，并且具有相當小的斯托克斯位移(15～30 nm).基于BODIPY的強吸電子性質，引入給電子基團可促使吸收和發射波長紅移.例如，Mcdonnel等[32]在3，5-位將己二甲胺基引入苯環，可使其在三氯甲烷溶液中吸收和發射光譜的峰值分別從650和672 nm顯著紅移到799和823 nm.近年來，基于BODIPY的NIR-Ⅱ型有機熒光材料也得到了迅速的發展.

氮雜BODIPY(aza-BODIPY)的水溶性較差，限制了它們在活體研究中的應用.為了解決該問題，Godard等[33]采用了一種新策略，通過在硼原子上引入銨基，制備出水溶性aza-BODIPY，命名為SWIR-WAZABY-01.無需親水性包封或PEG輔助，SWIR-WAZABY-01可直接用于腫瘤的NIR-Ⅱ成像(圖3).這種以aza-BODIPY為基礎的染料可以在腫瘤中迅速到達和累積，并在體內保留長達1周.

圖3 SWIR-WAZABY-01的結構及其用于腫瘤的熒光成像[33]

最近，Bai等[34]利用分子工程開發出一系列新的aza-BODIPY染料：NJ960、NJ1030和NJ1060.與經典的aza-BODIPY相比，該類分子在強D-A分子內電荷轉移(ICT)效應的幫助下可將近紅外發射光譜紅移到NIR-Ⅱ.此外，該類染料具有很好的光物理性能，如斯托克斯位移大、光穩定性好、水溶液中熒光亮度大等，其中NJ-1060在NIR-Ⅱ熒光量子產率高達1.00%，并且體內NIR-Ⅱ熒光成像結果表明NJ-1060具有高分辨率和深穿透成像能力.

1.4 基于共軛聚合物的NIR-Ⅱ染料

富電子供體和吸電子受體可使共聚物的帶隙變小，因此通過D-A交替共聚生成的共軛聚合物具有帶隙小、易調整的優點，是NIR-Ⅱ探針設計的一種有效途徑.半導體聚合物點(Pdots)是近年來出現的一種新型有機熒光材料.與傳統熒光染料相比，Pdots具有寬吸收、對稱窄發射、高光亮度、高光穩定性及大斯托克斯位移.因此，高熒光Pdots組成的納米顆粒被視為一種有效的熒光探針[35-36]，在生物成像、分子檢測、指導藥物治療等領域展現出廣闊的應用前景.

盡管Pdots由于其可調的光學特性，在生物成像和生物傳感方面具有很強的實用價值，但是與有機溶劑中的原始聚合物相比，納米粒子形式的半導體聚合物通常表現出熒光猝滅，可歸因于鏈間和鏈內π-π堆積的強相互作用，從而導致非發射性激子和激基復合物的形成[37-38].隨著發射能量的降低，無輻射衰減率顯著增加，很難獲得高量子產率的NIR-Ⅱ熒光團.最近，Zhang等[39]提出了一種雙重熒光增強機制來增強Pdots的NIR-Ⅱ熒光，通過分子工程策略開發了9種NIR-Ⅱ半導體聚合物.在該研究中，一方面利用吩噻嗪單元的聚集誘導發射特性來減少聚集態聚合物的非輻射衰變路徑；另一方面引入了大量的側鏈基團，通過空間位阻來減弱鏈間和鏈內π-π堆積產生的強相互作用，進一步增強熒光量子產率.基于這種雙重增強策略制備的P3cPdots在水溶液中的熒光量子產率約為1.70%，比四氫呋喃溶液中的原始聚合物增強約21倍.活體小鼠頭蓋部熒光成像有顯著改善，表明這種雙重增強策略在設計活體熒光成像的NIR-Ⅱ熒光團方面具有潛在應用前景.

另外，針對Pdots在水溶液中往往會出現嚴重的熒光猝滅問題，Liu等[40]通過在聚合物受體的不同位置引入氟原子，利用分子調控NIR-Ⅱ熒光增強策略，減少聚合物與水分子的相互作用和非輻射越躍，從而提高NIR-Ⅱ熒光量子效率(圖4).分別以苯并二噻吩(BDT)和三唑[4,5-g]-喹喔啉(TQ)衍生物為供體和受體，設計了兩種含氟半導體聚合物.光物理實驗結果顯示：在808 nm光激發下，聚合物發射光譜覆蓋了NIR-Ⅱ，肩峰延伸超過1 300 nm；隨著氟化程度的加深，聚合物發射光譜紅移.隨后利用密度泛函理論表明氟化使激發態和基態之間的結構畸變減小，從而減少了非輻射弛豫，增強了Pdots的熒光量子產率.最后用Pdots進行小鼠顱骨腫瘤血管系統的活體熒光成像，獲取了一系列高穿透深度和高信背比的熒光圖像.

圖4 納米尺度氟化效應的示意圖[40]

各種有機NIR-Ⅱ熒光探針的關鍵參數和應用總結于表1.

表1 有機NIR-Ⅱ熒光探針的比較

2 無機NIR-Ⅱ熒光探針

與NIR-Ⅱ有機小分子染料相比，NIR-Ⅱ納米探針具有相對較高的量子產率和較低的光漂白敏感性，在肝臟、腎臟、大腦和肺成像等領域具有獨特優勢.目前，已開發如稀土納米粒子(RENPs)、量子點(QDs)、金納米團簇(AuNCs)、單壁碳納米管(SWNTs)等材料作為NIR-Ⅱ探針[41-43].在此，介紹基于無機材料的NIR-Ⅱ熒光探針的開發及其在生物成像領域的應用，并重點關注近期新型無機NIR-Ⅱ熒光探針的研究進展.

2.1 稀土納米材料

RENPs具有較大的斯托克斯位移、較小的光漂白、狹窄和多峰值的發射特性以及可忽略的激發-發射帶重疊，因此受到越來越多的關注.此外，由于可通過摻雜不同的稀土金屬離子來調諧發射波長和延長發光壽命[43-45]，RENPs成為NIR-Ⅱ熒光成像的研究熱點，有著很廣泛的應用前景.

由于具有很長的熒光壽命(ms級別)以及很大的斯托克斯位移(≥200 nm)，鑭系RENPs作為熒光探針被廣泛使用.最近，Li等[46]以77.5∶20.0∶2.5的摩爾比混合1,2-二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、膽固醇(Chol)和聚乙二醇化脂質(DSPE-PEG2000)合成脂質體，然后使用該脂質體進一步包覆NIR-Ⅱ鑭系熒光基團RENPs，得到在1 064和1 345 nm處雙發射、大斯托克斯位移(分別為264和545 nm)的RENPs@Lips.RENPs@Lips在1 064 nm處的量子產率為7.90%，在808 nm激發下1 345 nm處的量子產率為4.10%.此外，RENPs@Lips顯著增強了靜脈排泄性和膠體穩定性，縮短了在網狀內皮系統中的停留時間，并且超過90%的RENPs@Lips靜脈給藥后72 h內可以從肝臟排出.與之前報道的RENPs@DSPE-mPEG相比，RENPs@Lips的體內清除速度快且半衰期短；同時，未發現明顯的RENPs@Lips骨積聚，這有助于減少骨系統滯留和加速靜脈清除.這些結果表明RENPs@Lips具有良好的生物相容性、靜脈內排泄性和優異的光化學性質，適合于臨床前評估和監測生理和病理過程，可促進其未來的臨床轉化.

據報道，稀土元素Yb/Er共摻雜納米顆粒(ErRENPs)具有NIR-Ⅱ波長的發光特性，并表現出斯托克斯位移大(高達450 nm)、壽命長、光穩定性好等優點，被認為是新一代近紅外探針的優異候選者.然而，Er3+容易發生能量轉移到納米晶體表面的現象，導致嚴重的熒光猝滅.最近，Cao等[47]采用Nd3+敏化Yb3+的體系，在內部Ce3+的輔助下將能量轉移到發光中心Er3+上.該研究中，在內核中摻雜Er3+作為激活劑，并在核心層和中間層混合Yb3+作為敏化劑，之后在NaYbF4:Er核納米晶中進一步摻雜Ce3+以增強NIR-Ⅱ發射，并通過調節摻雜離子來優化納米粒子的發光性能.引入PEG配體提高了納米顆粒的水溶性(圖5)，實現了較長的血液循環時間.通過采集其NIR-Ⅱ熒光信號，該納米探針可用于腫瘤的高分辨率追蹤和成像.

UCL.上轉換熒光.

2.2 QDs

QDs具有寬激發光譜、窄發射光譜、高量子產率、抗光漂白等優點，在活體生物成像中具有很高的時空分辨率，因此引起了人們的廣泛關注.已有研究通過對PbS、CdSe、Ag2S等QDs的尺寸和形狀進行微調，可以調節其藥代動力學和組織分布[48-49].

PbS QDs具有多種獨特的特性，包括窄帶隙、大玻爾半徑、在近紅外區可調諧和強發射，使其廣泛應用于光電子器件、傳感器和活體成像等領域[48].目前膠體法制備窄粒徑PbS QDs的方法已得到很好的發展，但在較高的溫度下，該方法制備的納米晶很不穩定.此外，由于表面易被氧化，其光學性質對空氣和水相當敏感，限制了它們在生物成像中的應用.Shi等[51]通過陽離子摻雜工藝，制備了一系列高質量的鋅摻雜PbS QDs，發現鋅摻雜后可以形成摻雜態，降低了主體PbS的能隙，有效增強了PbS QDs的量子產率和光致發光壽命，并改善了QDs在高溫下的熒光穩定性.這種陽離子摻雜策略為制備波長更長的更小粒子提供了一種新方案，可批量制備一系列波長覆蓋整個NIR-Ⅱ的高質量QDs，為近紅外光學成像提供了新工具；同時，PEG化的QDs可用于活體小鼠的腦血管無創高分辨熒光成像，實現了在毛細血管水平上高分辨率的腦血管無創近紅外成像.

2.3 惰性金屬納米材料

惰性金屬基(如Au和Pt)發射體不易引起熒光猝滅，因此很適用于NIR-Ⅱ成像.AuNCs是其中一個典型的代表，其具有比腎臟排泄閾值更小的尺寸、良好的光穩定性、易于修飾、優異的光熱活性和多樣性等多種獨特優勢，因此成為極具發展前景的新型NIR-Ⅱ 探針[52-53].考慮到胃腸道的酸性和酶生物環境可能會導致大多數納米發射體的熒光猝滅，Wang等[54]提出合成惰性金屬基發射體用于胃腸道近紅外成像，以克服潛在的熒光猝滅問題.通過構建核糖核酸酶-A(RNase-A，由巰基和芳香族氨基酸組成)封裝AuNCs，得到具有一個完美高斯型發射峰的RNase-A@AuNCs，峰中心位于1 050 nm，FWHM約為205 nm，與大多數報道的新型金屬基成像劑相比，該發射峰相對狹窄，且RNase-A@AuNCs的量子產率為1.90%.將RNase-A@AuNCs暴露于胃腸道模擬液和哺乳動物細胞中以評估其穩定性和生物安全性，結果表明RNase-A@AuNCs具有高穩定性和良好的生物相容性.與兩個已報告的近紅外發射體(Ag2S和NaYF4:Er/Yb)相比，RNase-A@AuNCs胃腸道靈敏度提高了50倍以上.該研究首次將蛋白電暈技術應用在AuNCs上，將激發波長紅移到NIR-Ⅱ，并使用一個腸癌模型來證明AuNCs作為腫瘤診斷顯像劑的潛在效用.

近期，Li等[55]合成了粒徑3.3 nm左右的具有25個Au原子和18個肽配體的新型AuNCs,即Au25(SG)18，可在NIR-Ⅱ發射.由于天冬氨酸和亞氨基二乙酸等羧酸可以作為天然骨靶向配體，研究人員假設Au25(SG)18中豐富的羧酸側鏈能使其與骨結合，從而作為一種新型的骨顯像NIR-Ⅱ探針.該研究首次發現Au25(SG)18與羥基磷灰石具有良好的體外結合能力.通過結合Au25(SG)18，NIR-Ⅱ熒光成像能高分辨率和高對比度地描繪出體內骨結構，并探討了以Au25(SG)18作為骨組織術中NIR-Ⅱ熒光導航的潛在價值.

除具有NIR-Ⅱ成像能力外，帶裸Au原子的AuNCs還可通過形成Au—S共價鍵與某些含巰基的物種如谷胱甘肽(GSH)發生反應[56].Yang等[57]開發出一種雙功能的熱釋光納米藥物(AuNCs-Pt)，利用AuNCs來遞送Pt(Ⅳ)(圖6).一方面，AuNCs-Pt的NIR-Ⅱ成像能力保證了高分辨率的腫瘤深部模型中Pt轉運的有效可視化；另一方面，AuNCs-Pt通過Au—S鍵來結合GSH，以清除胞內GSH，從而有效地使腫瘤細胞對Pt類藥物敏感.結果表明，AuNCs-Pt能夠消除高危害的深部腫瘤，并減輕人體來源的肝癌異種移植的腫瘤負擔.因此，AuNCs-Pt作為一種診療一體化納米藥物，在最大限度利用Pt依賴性化療的同時，可通過高分辨率NIR-Ⅱ成像來監測Pt在深部組織中的運輸.

EDC.1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽;NHS.N-羥基琥珀酰亞胺;HCC.肝細胞癌.

2.4 SWCNTs

SWCNTs直徑約為1 nm，長度為幾百至幾千納米，在分散劑的幫助下可溶解在水溶液中.SWCNTs的斯托克斯位移較大，在近紅外波段具有良好的光穩定性和熒光發射，長期作為光學生物傳感器.此外，得益于良好的光熱轉化效率和光敏特性，SWCNTs已廣泛應用于光熱和光動力療法.近年來，由于其固有的寬NIR-Ⅱ熒光發射，SWCNTs越來越多地用于體內成像.例如，Welsher等[58]將SWCNTs作為第一代NIR-Ⅱ熒光探針應用于活體熒光成像，并在NIR-Ⅱ獲得了更深層的組織穿透力和更高的時間和空間分辨率(<300 ms，約10 μm).此外，SWCNTs還應用于高性能血流動力學成像、全身血液循環和淋巴系統跟蹤、腫瘤手術指導等領域[59].

由于NIR-Ⅱb(1 500～1 700 nm)具有最低的光散射，所以在NIR-Ⅱb進行活體生物成像能提供更高的空間分辨率、更深的組織穿透以及更好的信背比.目前，大多數基于高壓一氧化碳轉化(HiPCO)的NIR-ⅡSWCNTs直徑分布為0.7～1.1 nm，熒光發射范圍為1 000～1 400 nm[60-61]；而具有更大直徑的SWCNTs能夠在更長波長區域實現高分辨率的熒光成像.最近，Diao等[62]通過激光氣化(LV)合成了平均直徑范圍為0.96～1.24 nm的NIR-Ⅱ發射體SWCNTs，在LV合成過程中將爐溫從950 ℃升高至1 125 ℃，使SWCNTs的平均直徑從約0.9 nm變為1.4 nm.與先前廣泛使用的HiPCO-SWCNTs相比，由于帶隙較小和平均直徑較大，LV SWCNTs在NIR-Ⅱb顯示出更高的熒光.利用該SWCNTs作為體內NIR-Ⅱb熒光造影劑，發現小鼠后肢和大腦(顱骨和頭皮完整)的活體血管成像的空間分辨率約4 mm，深度可達3 mm.

SWCNTs的體內潛在毒性問題是其臨床轉化的一大障礙，為了克服該問題，Takeuchi等[63]利用磷脂PEG包裹摻氧的SWCNTs得到O-SWCNT-PEG，并研究O-SWCNT-PEG給藥后的生物反應.在980 nm光激發下O-SWCNT-PEG可以發射1 300 nm的NIR-Ⅱ熒光，適合用于體內NIR-Ⅱ熒光成像;將O-SWCNT-PEG經靜脈注射到活體小鼠體內，作為血管成像的對比劑，研究了造影探針在體內的滯留時間、生物分布、毒性等生物學特征(圖7).結果發現經尾靜脈注射后，O-SWCNT-PEG在血管內循環時間約為3 h，大部分在1 d內從體內清除.此外，使用液相色譜-質譜聯用對主要代謝物和脂質代謝進行分析，結果發現實驗動物的免疫反應可忽略不計，并且幾乎所有生物標記物在給藥1個月后恢復到正常值.該研究表明O-SWCNT-PEG是一種生物相容性良好的探針，有效克服了SWCNTs的毒性問題，可用于NIR-Ⅱ波長范圍內的血管造影成像.

(a)注射30 μg O-SWCNT-PEG后的小鼠活體成像；(b)血液和肝臟隨時間變化的熒光強度；(c)給藥后肝臟、脾臟、肺、腎和心臟的離體熒光成像.

各種無機NIR-Ⅱ熒光材料的關鍵參數和應用總結于表2.

表2 無機NIR-Ⅱ熒光探針的比較

3 展 望

有機NIR-Ⅱ材料通過調節分子結構可以有效地優化光譜學性質，并且易降解，生物毒性小，在體內成像應用方面具有很大的潛力.花菁類NIR-Ⅱ熒光團合成過程相對簡單，通過延長聚次甲基鏈、增加雜環的供體強度，可使發射波長紅移.D-A-D型生色團具有較大的斯托克斯位移(約200 nm)和較高的成像質量，在1 000 nm 以上具有優異的光致發光和電致發光性能，并且通過調節D-A-D熒光團的受體和供體結構，可以有效地改變吸收和發射光譜特征.值得注意的是，上述兩類小分子染料具有生物相容性好、循環時間短、體內代謝快等優點，避免了長期毒性問題；但存在量子產率較低、水溶性和生物體內穩定性較差等不足，往往需要通過改造來提高水溶性，例如將小分子染料包裹在聚合物基質中，但這大大增加了它們的大小，超過40 ku的腎臟清除閾值.因此，需通過合理的策略以消除上述障礙.共軛聚合物具有高度離域的π-共軛主鏈和可配置的側鏈，這賦予了它們可調節的光物理性質和多功能性.此外，共軛聚合物通常具有吸收系數大、熒光量子產率高、光穩定性好等優點，但尚存在分子質量和分子結構不確定性等問題.總體而言，有機NIR-Ⅱ熒光團具有優良的光學性能、良好的生物相容性、較低的毒性等特點，并且其理化性質可通過結構修飾來調節，因此在未來臨床中具有很大的應用前景.

近年來，國內外科學家開發出一系列性能優異的無機NIR-Ⅱ熒光納米探針.與小分子熒光體相比，無機納米熒光體如QDs和AuNCs，顯示出較高的量子產率和較低的光漂白敏感性，常被用于肝臟、腎臟、大腦和肺成像；然而這些材料容易在肝/脾部位滯留和積累，不易被機體排泄.SWCNTs在NIR-Ⅱ具有強熒光性，能實現深層組織穿透和高空間分辨率熒光成像；但是其溶解度和生物相容性較差，這導致在表面改性之前無法直接用于生物成像.RENPs由于其大斯托克斯位移、窄和多峰的發射光譜、可忽略的激發-發射帶重疊以及優異的光穩定性而受到越來越多的關注；但是與大多數報道的NIR-Ⅱ 無機納米材料一樣，在網狀內皮系統中滯留時間長和無法從活體清除增加了其潛在的安全隱患，是未來生物醫學應用和轉化中不可忽視的障礙.

與傳統的NIR-Ⅰ成像技術和其他醫學成像方法相比，NIR-Ⅱ生物成像技術不僅成像深度更深，而且可以更好地避免組織自發熒光和光子散射等背景干擾.目前，已經成功合成和制備了有機小分子材料、共軛聚合物、無機納米材料(稀土納米材料、半導體QDs和SWCNTs)等多種NIR-Ⅱ材料.NIR-Ⅱ材料由于其獨特的優異性，不僅可以作為生物醫學造影劑，而且可用于光熱和光動力治療、藥物遞送、手術指導和移植干細胞的跟蹤等領域.

本文概述了新型NIR-Ⅱ熒光材料的設計思路及其多樣化的生物應用.雖然NIR-Ⅱ熒光材料的發展豐富了人們對NIR-Ⅱ生物成像領域的認識和應用，但是目前的工作主要集中在基礎研究上，在臨床上的應用還有很長的路要走.總體來說，NIR-Ⅱ熒光材料的開發設計要考慮以下幾點：首先，最值得關注的問題是，生物相容性差及潛在的生物毒性可能會對人體生理功能產生影響，損害人體健康；其次，NIR-Ⅱ熒光材料的熒光量子產率低、發射波長短、化學合成過程繁瑣耗時等缺點會阻礙其產業化發展；最后，除通過合理的策略消除上述障礙外，NIR-Ⅱ熒光材料在動物模型中的活性、毒理學和藥代動力學評價測試，對于NIR-Ⅱ熒光成像的進一步發展至關重要.