激光解吸介質阻擋放電電離質譜快速檢測蘋果表皮的農藥殘留

楊曼青，陸 橋，Zenobi Renato，杭 緯

(廈門大學化學化工學院，譜學分析與儀器教育部重點實驗室，福建 廈門 361005)

隨著農業的快速發展以及新型農藥的不斷涌現，農藥在當前農業生產中得到愈加廣泛的應用，其對農作物的保護、增產作用是毋庸置疑的，但由此帶來的農藥殘留問題也越來越受到人們的廣泛關注.長期食用農藥殘留超標的食物，會增加人體肝臟和腎臟的負擔，造成慢性甚至急性中毒.研究表明長期接觸并使用農藥會增加致癌和致畸的風險[1-3].根據農藥的生物活性和具體的分析要求，食品果蔬中農藥的最大殘留限量(maximum residue limit,MRL)從1 μg/kg量級到1 mg/kg量級不等.我國已經對果蔬中農藥的MRL進行嚴格限制，以盡量減少農藥帶來的危害[4].

傳統的農藥檢測方法主要是基于分離的氣相色譜-質譜聯用技術(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)[5]和高效液相色譜-質譜聯用技術(high performance liquid chromatography-mass spectrometry, HPLC-MS)[6]，它們可以實現對農藥殘留以及食品添加劑等的精準定量檢測.近年來隨著高分辨MS以及串聯MS的引入，未知待測物定性識別難的障礙也已經被克服[7]，并且已經發展成為當前各國農藥殘留檢測的主要手段.但是這類方法往往需要對樣品進行溶解、萃取、濃縮，甚至提純等繁瑣的前處理步驟，檢測耗時長、成本昂貴；而且基于色譜分離的檢測技術會不可避免地產生基質效應，影響檢測結果的可靠性[8].因此迫切需要開發無需或僅需少量樣品前處理步驟、高通量、低成本的方法，用于原位快速檢測復雜基質表面的農藥殘留.

20世紀70年代，激光的問世有力地推動了MS在表面分析科學的發展，激光解吸電離質譜(laser desorption ionization mass spectrometry, LDI-MS)憑借超快速、極微量、高通量、原位采樣的優勢已經被廣泛應用于生命醫學、材料分析、物質檢測等領域[9-11].然而傳統的LDI-MS技術對解吸分子的電離效率較低，進入MS的粒子絕大多數以中性分子形式存在，它們不但不能被檢測器捕獲，還容易沉積在MS腔體內造成儀器污染.為了解決上述問題，近年來在激光解吸采樣之后引入后電離裝置，用以提高電離效率的嘗試備受研究者的青睞.Herdering等[12]采用213 nm Nd:YAG紫外激光器耦合大氣壓化學電離源和軌道離子阱MS，搭建了一臺激光濺射大氣壓化學電離質譜(laser ablation atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry, LA-APCI-MS)，用于藥片中主要成分咖啡因和對乙酰氨基酚的檢測.Zhou等[13]采用2 940 nm紅外激光器耦合電噴霧電離(electrospray ionization，ESI)源以及飛行時間MS，用于新鮮肉類的種類鑒定，并通過主成分分析以及偏最小二乘判別分析證明該方法準確性高且適用性強.Zhang等[14]采用多波長可調激光器(355，532，1 064 nm)耦合實時直接分析(direct analysis in real-time,DART)電離源，構建了一臺等離子體輔助多波長激光解吸電離質譜(plasma assisted multi-wavelength laser desorption ionization mass spectrometry,PAMLDI-MS)，成功用于檢測顏料混合物、標準藥物、茶葉萃取物等小分子.

介質阻擋放電電離(dielectric barrier discharge ionization,DBDI)是一種通過在介質相隔的兩電極間施加交變電流，放電產生低溫等離子體使周圍氣化的分子電離的技術.它可以在不加熱樣品的條件下對中性分子實現高效軟電離[15]，而且裝置體積小，可以與任何大氣壓MS直接連接，自2007年被清華大學張新榮課題組提出以來，被廣泛應用于分析檢測領域[16-17].基于此，本研究搭建了一臺激光解吸介質阻擋放電電離質譜(laser desorption coupled dielectric barrier discharge ionization mass spectrometry,LD-DBDI-MS)，它的主要優勢在于：1)與傳統的激光解吸后電離技術相比，該裝置不需要溶劑以及額外氣體輔助電離，降低了裝置的復雜性；2)將介質阻擋放電毛細管與MS毛細管接口直接相連，顯著提高了電離、傳輸效率以及檢測信號的穩定性.本研究利用該裝置對蘋果表皮復雜基質中的農藥殘留進行原位定性和半定量檢測，結果表明該方法穩定、靈敏，能夠作為蘋果表皮復雜基質中農藥殘留超標檢測的工具.

1 儀器與方法

1.1 試 劑

三環唑(C9H7N3S，Mw=189.25，純度98%)和抑霉唑(C14H14Cl2N2O，Mw=297.18，純度98%)均購自北京伊諾凱試劑公司，乙醇(C2H6O，純度99.99%)購自國藥集團化學試劑有限公司.實驗所用農藥和乙醇均為分析純，使用前沒有進一步純化.實驗所用的蒸餾水均產自Milli-Q超純水系統(Millipore,美國).

1.2 樣品制備

農藥標準品溶液的制備：分別稱取10 mg三環唑和抑霉唑標準品，溶解于10 mL乙醇中，配制成1 000 mg/L的儲備液于4 ℃下冷藏待用；用去離子水稀釋儲備液獲得其他濃度的標準品溶液.移取2 μL特定濃度的農藥標準品溶液，點樣于潔凈的載玻片上，室溫下晾干，用雙面膠將載玻片固定于樣品靶上等待分析.除另有說明外，本研究的所有農藥殘留濃度均表示干燥前溶液中農藥的質量濃度(mg/L或μg/L).

真實樣品的制備：蘋果(購自廈門大學附近超市)用去離子水清洗3次，自然晾干后用鉛筆在蘋果表皮上標記出2.5 cm×2.5 cm 的區域，采用10 μL的GC注射器向該區域均勻添加10 μL特定濃度的三環唑標準品溶液，自然風干，切下厚度約1 mm的果皮，用雙面膠固定于樣品靶上進行檢測.

1.3 DBDI離子源

DBDI裝置的工作原理在文獻[18-19]中已有詳細介紹.一根石英玻璃毛細管(內徑0.7 mm,外徑1.0 mm)被連接到MS(毛細管)入口，MS儀內恒定的低壓保證了毛細管內的空氣流量固定為1.37 L/min.石英毛細管中水平插入一根長23 mm的不銹鋼毛細管(內徑0.5 mm,外徑0.6 mm)作為接地電極，一個長5 mm包裹在石英毛細管周圍的銅環(內徑1.0 mm)作為高壓電極.樣品以及空氣在MS儀的負壓作用下直接從不銹鋼毛細管被吸入DBDI源.在兩電極間施加約3 kV、40 kHz的正弦調制交流電，石英毛細管內由介質阻擋放電激發產生等離子體，這些等離子體用來電離通過毛細管的空氣以及待測分子，無需額外氣體輔助電離.石英玻璃毛細管外部采用聚氯乙烯/聚四氟乙烯外殼包裹，以確保操作人員的安全.

1.4 激光解吸系統

采用輸出波長為532 nm的燈泵緊湊型電光調Q激光器penny-A-100(鞍山紫玉激光科技有限公司)作為解吸采樣源.激光脈沖重復頻率10 Hz，脈寬10 ns，能量0～35 mJ可調，激光水平方向射出，經反射鏡反射光路改變90°，聚焦透鏡到樣品靶的距離為10 cm，使得解吸光斑恰好豎直落在樣品表面.樣品靶以15°傾角朝向DBDI毛細管入口放置.手動微調樣品靶，使得激光采樣點到DBDI毛細管入口的距離固定為2 mm，以保證最大數量的解吸分子被吸入DBDI毛細管.樣品靶通過x-y-z三維移動平臺精確控制(北京北光世紀儀器有限公司).

1.5 MS儀

本研究采用高分辨四級桿飛行時間MS(Impact Ⅱ,德國布魯克公司)，移去MS儀原本搭配的ESI源，將自制的DBDI源與MS入口相連接.MS毛細管電壓為0 V，入口毛細管溫度保持在180 ℃，管透鏡補償電壓為200 V.數據采集質量窗口設置為m/z=50～1 300，質量分辨率在m/z=190.03處為28 000.本研究中所有MS數據均在正離子模式下采集，使用Quant Analysis version 4.3軟件(德國布魯克公司)對采集到的數據進行后處理.水果表皮復雜基質中待測農藥分子通過串聯MS進行定性識別.

2 結果與討論

LD-DBDI-MS的實驗裝置如圖1所示，激光經聚焦透鏡聚焦后從正上方豎直濺射樣品靶上的待測物表面.DBDI源與MS入口直接相連，空氣作為載氣，激光解吸的物質混入空氣流以恒定的流速從不銹鋼毛細管內電極直接進入DBDI源電離，電離后的分子被直接傳送到MS儀進行質量分析.

圖1 LD-DBDI-MS的實驗裝置示意圖

激光被譽為“一把鋒利的刀”，無論待測物是液體還是固體，它都可以在短時間內將樣品表面的物質解吸氣化為羽狀，但是氣羽分子中被電離的粒子僅占千分之一左右甚至更低[20]，因此為了高效利用“廢棄”的中性粒子，本研究引入DBDI后電離裝置.三環唑和抑霉唑是兩種內吸型廣譜殺菌劑，毒性中等，藥效持久，本研究以二者為模型分子進行實驗.在其他條件完全相同時分別采用LDI-MS和LD-DBDI-MS兩種模式得到三環唑和抑霉唑標準品溶液(100 mg/L)的殘渣MS譜圖(圖2)，可以明顯看出當只使用激光解吸電離時，三環唑質子化離子峰([M+H]+，m/z=190.04)和抑霉唑分子離子峰(M+，m/z=297.04)的信號均較弱，主要是因為激光更大程度上將待測分子解吸，而電離效率不足，使得進入MS的絕大多數粒子以中性形式存在，不能被檢測器捕獲.在激光解吸之后引入DBDI后電離裝置，三環唑質子化離子峰信號強度提高了約500倍，抑霉唑分子離子峰信號強度提高了約100倍.由此可見，DBDI后電離裝置可以高效電離激光解吸產生的中性粒子，使得MS信號顯著提升，同時在LD-DBDI-MS譜圖中并未發現明顯的待測物碎片峰，這也印證了DBDI軟電離的特性.DBDI對兩種待測分子電離形式差異的主要原因是：電離所用載氣為空氣，空氣中含有大量水蒸氣，經等離子體電離后能夠形成水分子簇陽離子；三環唑分子中唑環氮原子是強質子化位點，容易接收水分子簇陽離子中的質子，發生質子轉移反應，使得電離效率極大增強，而抑霉唑分子的質子化位點相對較弱，更傾向于發生電荷轉移反應，即等離子體使空氣中的氮氣分子電離產生N2+，抑霉唑分子中的電子再被N2+奪取，進而產生樣品分子離子M+.

*為背景峰.

2.1 LD-DBDI-MS檢測農藥標準品

首先依據三環唑質子化離子峰信號強度優化實驗參數.采用2 μL 100 mg/L的三環唑([M+H]+，m/z=190.04)標準品溶液的點樣殘渣，考察激光功率密度、激光濺射點與DBDI毛細管入口的距離、樣品靶與水平方向的夾角對MS信號的影響.由圖3(a)可知，三環唑質子化離子峰信號強度會隨著激光功率密度的增大先增強后減弱，當功率密度達到668 MW/cm2時信號最強.這可能是因為：隨著激光功率密度增大，單次解吸樣品的量增多，獲取的信號增強；當激光功率密度過大時，樣品濺射羽的擴散也隨之變強，導致最終進入DBDI毛細管的氣態樣品濃度降低，檢測信號減弱.由羽狀擴散動力學可知，激光采樣點與DBDI毛細管入口的距離以及樣品靶與水平方向的夾角均會顯著影響采樣效率，進而影響信號強度.如圖3(b)所示，當激光采樣點到DBDI毛細管入口的距離為2 mm 時，MS信號基本達到最強，繼續縮小距離則MS信號沒有明顯增強，但是激光采樣點距離DBDI毛細管入口過近時，存在灼蝕DBDI的風險，因此將最佳距離設定為2 mm.樣品靶與水平方向的夾角直接影響濺射羽的擴散方向，由圖3(c)可知，樣品靶與水平方向夾角為15°時檢測信號最強，推測是因為解吸羽的擴散方向正好與DBDI入口最佳耦合，此時最大數量的解吸分子進入DBDI毛細管.因此后續實驗均在激光功率密度為668 MW/cm2，激光采樣點與DBDI毛細管入口的距離為2 mm，樣品靶與水平方向夾角為15°的條件下進行.

圖3 激光功率密度(a)、激光采樣點與DBDI毛細管入口距離(b)以及樣品靶與水平方向夾角(c)的優化曲線

為了驗證該裝置的檢測靈敏度以及信號穩定性，取2 μL質量濃度分別為5，10，25，50，100，250和500 μg/L的三環唑標準品溶液以及10，100，250，500和1 000 μg/L的抑霉唑標準品溶液，點樣于載玻片上，晾干后進行檢測，每個質量濃度進行多次重復實驗取平均值，建立如圖4(a)和(b)所示的三環唑的質子化離子峰和抑霉唑分子離子峰信號強度與其標準品溶液質量濃度之間的線性標準曲線，基于3倍信噪比(S/N=3)計算可得檢測限分別低至2和7 μg/L.為了評估該方法的絕對檢測質量，取2 μL摻雜中性紅的三環唑標準溶液點樣于載玻片上，晾干后形成紅色樣斑.采用形狀測量激光顯微系統(VK-X250K，Keyence，日本)表征樣品斑點直徑為2 mm.經過激光單次濺射后再次表征采樣點，如圖4(c)所示，中心100 μm的亮斑為激光濺射區域，外圍直徑為300 μm的稍亮區域為樣品解吸區.基于檢測限2 μg/L計算，添加2 μL三環唑標準品溶液，即4 pg, 樣斑直徑為2 mm，激光解吸直徑為300 μm,因此該方法對三環唑標準品的絕對檢測量低至90 fg，說明該方法具有高的檢測靈敏度，可用于痕量樣品的檢測.接著用250 μg/L的三環唑標準品溶液依次制樣30個，以檢驗該方法的信號穩定性.如圖4(d)所示，橫坐標代表采樣個數，縱坐標為MS信號強度，水平線代表信號平均值，由此可見本方法信號穩定性在可控范圍之內，相對標準偏差(RSD)為17.5%.

圖4 三環唑(a)和抑霉唑(b)的線性標準曲線，激光采樣光斑圖(c)，以及三環唑標準品溶液的重現性測試(d)

2.2 蘋果表皮農藥殘留的原位檢測

為了檢驗LD-DBDI-MS在實際樣品中的定性和半定量分析檢測能力，采用標準加入法，將已知量的三環唑和抑霉唑標準品溶液均勻添加到潔凈的蘋果表面，用以模擬真實蘋果表面的農藥殘留.將分別添加了三環唑和抑霉唑的蘋果表皮固定于樣品靶上，采用激光直接解吸采樣.由于實際樣品所得的MS譜圖存在一定的基質背景，為了準確辨別蘋果表皮的三環唑殘留分子信號，接下來采用串聯MS進一步辨別復雜基質中的目標化合物.通過碰撞誘導解離(collision induced dissociation,CID)實驗，碰撞能量設置為30 eV，氮氣作為碰撞氣體，質量窗口寬度為±1 u，對三環唑質子化離子峰(m/z=190.04)進行碎片化.如圖5(a)所示，產生m/z=163，136，109和92的碎片峰，這與三環唑標準品以及文獻[21]報道的三環唑碎片離子峰完全一致.本研究還對蘋果表皮檢測到的抑霉唑分子離子峰(m/z=297.04)進行CID實驗，產生m/z=255，201和158的抑霉唑特征碎片峰及m/z=299的抑霉唑分子離子同位素峰(圖5(b))，再次驗證了該裝置擁有特異性識別復雜基質表面目標化合物的功能.

圖5 LD-DBDI-MS/MS檢測蘋果表皮殘留的三環唑(a)和抑霉唑(b)

為了進一步檢驗該方法在實際樣品中的檢測精度，用鉛筆在未檢測出外源物的蘋果表面標記出2.5 cm×2.5 cm 的待測區域，采用10 μL的注射器向該區域均勻添加10 μL質量濃度分別為0.1，0.5，1，10，100和1 000 mg/L的三環唑標準品溶液，自然風干，標記處的蘋果皮直到檢測時才被切下置于樣品靶上進行檢測，以保證檢測結果的最大真實性.將獲得的三環唑質子化離子峰(m/z=190.04)的信號強度與對應的添加質量濃度建立線性曲線，每個質量濃度至少檢測5次，取平均值.所得的蘋果表皮的三環唑殘留線性曲線如圖6所示，檢測限低至0.1 mg/L，并且真實樣品在跨越4個數量級的質量濃度范圍內(0.1～1 000 mg/L)具有良好的線性關系(R2=0.961 9).

圖6 LD-DBDI-MS法獲得的蘋果表皮殘留的三環唑質子化離子峰信號強度與質量濃度的線性曲線(n=5)

蘋果中農藥殘留的質量分數計算方法采用如下公式：

(1)

其中：w為蘋果中農藥殘留的質量分數，mg/kg；m為能夠檢測到的三環唑質量，ng；r為蘋果的半徑，約為4 cm；S是待測蘋果皮的面積，6.25 cm2；M表示蘋果的總質量，250 g.

當添加10 μL 0.1 mg/L三環唑溶液(相當于向待測蘋果表皮添加1 ng的三環唑)時，可以獲得確定的檢測信號，被認為是目前該方法在實際蘋果表皮的最低檢測質量.代入式(1)計算可得，三環唑殘留相對于整個蘋果質量的質量分數為130 μg/kg(這里將蘋果視為圓形)，遠低于國家標準GB 2763—2019[4]規定的三環唑果蔬類MRL(2 mg/kg)，證明該方法能夠作為蘋果表皮農藥殘留超標快速檢測的工具.

3 結 論

本研究采用LD-DBDI-MS結合標準品加入法，建立了蘋果表皮痕量農藥殘留的定性和半定量檢測方法.該方法將激光原位、快速、高通量取樣的優勢與DBDI高效、軟電離的特性相結合，實現了待測分子解吸與電離在時間和空間上的分離，便于對兩個過程進行分別優化，并且基于主動毛細管進樣的設計，不需要額外的氣體輔助電離，同時使得電離和傳輸效率顯著提高.該方法具有良好的穩定性(RSD=17.5%)以及高的靈敏度，對于三環唑標準品溶液的檢測限可低至2 μg/L，實際樣品蘋果表皮三環唑的最低檢測量低至1 ng，相當于130 μg/kg，遠低于國家標準GB 2763—2019所規定的果蔬類三環唑MRL(2 mg/kg)，而且在0.1～1 000 mg/L跨越4個數量級的質量濃度范圍內具有良好的線性關系(R2=0.961 9).與傳統的基于色譜分離的技術相比，該方法操作簡單，無需樣品前處理，1 min之內即可實現對復雜基質中殘留農藥分子的原位快速檢測，有望成為水果等農藥殘留超標的快速檢測工具.