HPLC法測定金澤冠心膠囊中澤瀉醇B-23-乙酸酯的含量

萬 能

（湖南食品藥品職業(yè)學(xué)院，湖南長沙 410208）

金澤冠心膠囊其功能與主治為增加心肌營養(yǎng)性血流、降低心肌耗氧量和調(diào)節(jié)血脂的作用，用于冠心病、心絞痛和高脂血癥。由澤瀉和雪膽兩味中藥材組成，處方中君藥澤瀉，中國藥典2015版標(biāo)注為澤瀉科植物澤瀉Alisma orientalis（Sam.）Juzep.的干燥塊莖，味甘、淡，性寒，歸膀胱、腎經(jīng)；功效為利水滲濕、泄熱；常用于水腫脹滿、小便不利、尿少、泄瀉、眩暈、痰飲、熱淋澀痛等癥狀；現(xiàn)代化學(xué)研究表明澤瀉中主含的三萜類成分為澤瀉醇B-23-乙酸酯、澤瀉醇B-24-乙酸酯，它們均具有抗脂肪肝及保肝、利尿、降血脂等作用。收載于《部頒中藥成方制劑》第十一冊中，原標(biāo)準(zhǔn)中無含量測定，由于澤瀉中澤瀉醇B-23-乙酸酯的含量較高，故選擇澤瀉醇B-23-乙酸酯為含量測定指標(biāo)建立金澤冠心膠囊含量測定方法，來有效控制中成藥金澤冠心膠囊的內(nèi)在質(zhì)量，為其制劑質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器設(shè)備與試藥

1.1 儀器設(shè)備

高效液相色譜儀 SPD-10A（日本島津）；AP 250D電子天平（上海奧豪斯國際貿(mào)易有限公司）；N3000色譜工作站（浙江大學(xué)智能工程有限公司）；超聲波清洗器（功率300W，頻率40kHz），KQ-300 型（蘇州昆山儀器有限公司）。

1.2 試藥

澤瀉醇B-23-乙酸酯對照品（含量98.5%，上海海燦生物科技有限公司，批號：ZX20190504）；金澤冠心膠囊由重慶市中藥研究院制藥廠提供。除乙腈為色譜純，水為純化水外，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜檢測條件

色譜柱為Hypersil ODS2（4.6×200mm，5μm大連依利特），流動相為乙腈-水（70∶30），流速1.0mL/ min，檢測波長210nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μl。

2.2 對照品（澤瀉醇B-23-乙酸酯）溶液的制備

精密稱取澤瀉醇B-23-乙酸酯對照品適量（五氧化二磷減壓干燥24h），加乙醇，制成每1mL含0.4mg的溶液，振搖即得。

2.3 供試品（溶液的制備）

取金澤冠心膠囊20粒的內(nèi)容物，準(zhǔn)確稱定重量，于研缽中研細(xì)，再精密稱定重量約1g，置磨口具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入50mL乙醇，用磨口塞密封，稱重，再超聲處理（頻率40kHz，功率300W，）30min，放冷后，再精密稱定重量，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，振搖均勻，再過濾，取續(xù)濾液，即得金澤冠心膠囊供試品溶液。

2.4 陰性（無澤瀉的金澤冠心膠囊）溶液的制備

取按處方比例配制的除澤瀉外的金澤冠心膠囊20粒，照上述供試品溶液制備的方法制備，即得陰性對照液。

2.5 專屬性實驗

分別準(zhǔn)確吸取上述對照品溶液和供試品溶液及陰性溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜檢測條件測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1，結(jié)果顯示：在上述的色譜條件下，澤瀉醇B-23-乙酸酯完全達(dá)到基線分離，與鄰峰分離度大于1.5，按澤瀉醇B-23-乙酸酯計算理論板數(shù)為14 089；陰性溶液色譜圖中在與澤瀉醇B-23-乙酸酯對照品色譜峰相應(yīng)位置上無峰，表明該方法專屬性強(qiáng)，陰性溶液無干擾。

圖1 金澤冠心膠囊HPLC圖

2.6 提取溶劑的選擇

取金澤冠心膠囊20粒的內(nèi)容物，準(zhǔn)確稱定重量，于研缽中研到所需要求，準(zhǔn)確稱取1g，共2份，兩份均精密稱重，分別置具塞磨口錐形瓶內(nèi)，編取標(biāo)號為①及②，編號①加入50mL甲醇，50mL乙醇，分別精密稱定重量，再超聲處理（頻率40kHz，功率300W）30min，放冷卻，再準(zhǔn)確稱重，分別用乙醇補(bǔ)足編號①和編號②減失的重量，振搖，濾過，取續(xù)濾液，即得。另精密稱取以五氧化二磷減壓干燥24h的對照品澤瀉醇B-23-乙酸酯適量，加乙醇制成每1mL含0.4mg的溶液，即得。精密吸取上述提取溶液及對照品溶液各10μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖；以主峰面積，按外標(biāo)法計算，結(jié)果見表1，結(jié)果表明：本品采用乙醇作為溶劑較好。

表1 提取溶劑考察結(jié)果表

2.7 提取方法考察

取20粒金澤冠心膠囊的內(nèi)容物，精密稱重，研細(xì)研勻，稱準(zhǔn)確取約1g，共制成2份，標(biāo)簽號為①和②，將編號①及編號②精密稱重，置具塞磨口錐形瓶中，在編號①②中均加入50mL乙醇，準(zhǔn)確稱定重量，標(biāo)號①超聲處理（功率300W，頻率40kHz）提取30min，標(biāo)號②回流提取30min，放冷到完全冷卻，再精密稱定重量，用乙醇補(bǔ)足標(biāo)號①②減失的重量，振搖搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。另精密稱取澤瀉醇B-23乙酸酯對照品適量，其要求在五氧化二磷減壓干燥24h方可稱重，加乙醇制成每0.4mg/mL的溶液，即得對照品溶液。準(zhǔn)確吸取上述溶液及對照品溶液各10μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計算，結(jié)果見表2，結(jié)果表明：樣品回流30min含量與超聲30min提取效果相近，由于超聲提取操作簡便，故選用超聲提取方法。

表2 提取方法考察結(jié)果表

2.8 提取時間考察

取金澤冠心膠囊20粒的內(nèi)容物，準(zhǔn)確稱定重量，研細(xì)研勻，精密稱取1g，共制成3份，分別精密稱定重量，置磨口具塞錐形瓶中，編號為①②③，在三個標(biāo)號的錐形瓶中均加入50mL乙醇，分別精密稱定重量，分別用功率為300W，頻率為40kHz的超聲處理，標(biāo)號①超聲處理20min、標(biāo)號②超聲處理30min、標(biāo)號③超聲處理40min，提取完成后分別放置冷卻，再準(zhǔn)確稱定重量，用乙醇補(bǔ)足標(biāo)號①②③減失的重量，過濾，取續(xù)濾液，即得。另準(zhǔn)確稱取澤瀉醇B-23-乙酸酯對照品適量，條件必須是在五氧化二磷減壓干燥環(huán)境下24h的對照品，加乙醇制成每1mL含0.4mg的溶液，即得。精密吸取上述溶液及對照品溶液各10μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖；以主峰面積，按外標(biāo)法計算，結(jié)果見表3，結(jié)果表明：樣品超聲處理30min已提取完全。

表3 提取時間考察結(jié)果表

2.9 線性關(guān)系考察

精密稱取澤瀉醇B-23-乙酸酯對照品適量，加乙醇制成0.67mg/mL的溶液，分別準(zhǔn)確吸取1、2、4、6、8μL注入高效液相色譜儀，依上述方法測定其峰面積，橫坐標(biāo)為進(jìn)樣量，縱坐標(biāo)為峰面積，繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為Y=1 213 111.85X-217 771.74，r=0.9999，結(jié)果表明：澤瀉醇B-23-乙酸酯對照品進(jìn)樣量在0.67～5.36μg線性關(guān)系良好。

2.10 精密度試驗

準(zhǔn)確吸取同一份供試品溶液10μL注入高效液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定其峰面積，峰面積分 別 為2 890 450、2 872 349、2 887 121、2 852 438、2 846 079，2 837 982，計算得RSD為0.57%，說明本方法精密度較好。

2.11 溶液穩(wěn)定性實驗

分別精密吸取供試品溶液10μL，于0、1、2、4、8h內(nèi)進(jìn)樣，測定其峰面積，結(jié)果見表4，RSD為0.70%，故供試品溶液在8h內(nèi)基本穩(wěn)定。

表4 穩(wěn)定性實驗結(jié)果

2.12 重復(fù)性試驗

取190801批樣品，按含量測定的方法，重復(fù)測定6次，平均含量為3.81mg/粒，RSD為0.78%，結(jié)果表明：該方法重復(fù)性較好。

2.13 回收率試驗

取本品（190 801批：含量為3.81mg/粒）內(nèi)容物適量，研細(xì)，取約0.5g，精密稱定，共5份，分別精密加入澤瀉醇B-23-醋酸酯對照品適量，編號為1、2、3、4、5，分別置磨口具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入25mL乙醇，用磨口塞密封，精密稱定重量，均用頻率為40kHz，功率為300W的超聲器超聲處理30min，提取完成后放置放冷，再分別精密稱定重量，用乙醇補(bǔ)足五份各自減失的重量，振搖搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。另精密稱取以五氧化二磷減壓干燥24h的澤瀉醇B-23-醋酸酯對照品適量，用乙醇制成含澤瀉醇B-23-醋酸酯0.4mg/mL的溶液，作為對照品溶液。分別準(zhǔn)確量取供試品溶液及對照品溶液各10μL注入高效液相色譜儀，按上述方法測定，計算回收率，結(jié)果見表5。

表5 回收率測定結(jié)果

2.14 樣品含量測定

取20粒金澤冠心膠囊內(nèi)容物，精密稱重，研磨研細(xì)，準(zhǔn)確稱取1g，稱定重量，置具塞磨口錐形瓶中，準(zhǔn)確加入50mL乙醇，用磨口塞密封，精密稱定重量，再用功率為300W，頻率為40kHz超聲器超聲處理30min，提取完成后自然冷卻，再準(zhǔn)確稱定重量，用乙醇補(bǔ)足提取過程中減失的重量，輕輕振搖直至搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。精密稱取澤瀉醇B-23-乙酸酯對照品適量，對照品要求：五氧化二磷減壓干燥24h，加乙醇制成每1mL含0.4mg的對照品溶液，即得。分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，測定結(jié)果見表6。

表6 金澤冠心膠囊樣品含量測定結(jié)果

3 結(jié)論

澤瀉為方中君藥，主要含三萜類，還含有倍半萜及二萜類等成分，其中澤瀉醇B-23-乙酸酯含量較高，故以澤瀉醇B-23-乙酸酯為指標(biāo)成分進(jìn)行含量測定。在溶劑選擇上，分別以甲醇、乙醇為提取溶劑，結(jié)果表明，乙醇對澤瀉醇B-23-乙酸酯提取效率高，故以乙醇作為提取溶劑。