紫杉醇調(diào)控NF-κB通路對(duì)FLT3-ITD突變急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株MOLM-13增殖和凋亡的影響*

周寶文，吳梅青，石澤延，白子文，姚奕斌，劉振芳,龐如利，趙衛(wèi)華

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，南寧 530021）

急性髓系白血病（acute myelocytic leukemia，AML）是由于造血細(xì)胞增殖能力提高、分化阻滯、凋亡障礙而引起的一類血液系統(tǒng)惡性腫瘤。其中，20%～30%的患者存在FLT3-ITD突變，此類患者往往誘導(dǎo)化療不容易緩解，易復(fù)發(fā)，預(yù)后較差，且約有75%初次診斷時(shí)攜帶有FLT3-ITD突變的患者復(fù)發(fā)時(shí)仍攜帶此突變[1-2]。美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）和歐洲白血病網(wǎng)絡(luò)（ELN）均將其列為AML患者預(yù)后不良的重要指標(biāo)[3-4]。目前，F(xiàn)LT3抑制劑靶向聯(lián)合化療雖取得了較好的療效，但耐藥的出現(xiàn)帶來了更大的挑戰(zhàn)，尋找新的聯(lián)合藥物是應(yīng)對(duì)耐藥的重要策略[5]。1992年美國食品和藥物管理局（FDA）已批準(zhǔn)紫杉醇（paclitaxel，PTX）用于晚期卵巢癌的治療，此后PTX被廣泛應(yīng)用于各種實(shí)體瘤的治療如乳腺癌、結(jié)直腸癌、膀胱鱗狀細(xì)胞癌、頭頸癌、小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌等[6-7]。PTX在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)免疫細(xì)胞還有調(diào)節(jié)功能[8]。近年來，一些基礎(chǔ)研究表明PTX能夠誘導(dǎo)不同類型白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡[9]。本研究旨在探討PTX在體外對(duì)FLT3-ITD突變AML細(xì)胞株MOLM-13增殖與凋亡的作用，并進(jìn)一步探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株FLT3-ITD突變AML細(xì)胞株MOLM-13購自南京科佰生物科技有限公司；FLT3未突變AML細(xì)胞株THP-1購自廣州賽庫生物技術(shù)有限公司。

1.2藥品、主要試劑及儀器PTX（上海源葉生物科技有限公司）；培養(yǎng)基及胎牛血清（Gibco）；CCK8試劑盒（美侖生物技術(shù)有限公司）；流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（美國BD公司）；Trizol RNA提取試劑和逆轉(zhuǎn)錄以及RT-qPCR試劑盒（大連Takara公司）。引物由生工生物工程股份有限公司合成。抗FLT3抗體、抗NF-κB抗體、磷酸化（p）NF-κB抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔IgG均購自CST公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)MOLM-13細(xì)胞和THP-1細(xì)胞均用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，取對(duì)數(shù)生長期、狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 CCK8法測(cè)定PTX對(duì)MOLM-13和THP-1細(xì)胞增殖的影響 本實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組（含有1‰DMSO溶劑）和實(shí)驗(yàn)組（2 nmol/L、4 nmol/L、8 nmol/L、10 nmol/L PTX），將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105個(gè)/mL，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組4個(gè)復(fù)孔，每孔100μL，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入10μL的CCK8溶液，37℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔450 nm處的吸光度（OD）值。按以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：存活率=[（實(shí)驗(yàn)組-空白組OD值）/（對(duì)照組-空白組OD值）]×100%。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 實(shí)驗(yàn)設(shè)為對(duì)照組（含有1‰DMSO溶劑）和實(shí)驗(yàn)組（4 nmol/L、8 nmol/L PTX），處理48 h后，分別收集MOLM-13細(xì)胞和THP-1細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞，用Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5μL Annexin Ⅴ，常溫避光孵育15 min，加入5μL PI以及300μL Binding Buffer，輕輕混勻，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。流式凋亡圖左上象限（Q1）表示壞死的細(xì)胞，右上象限（Q2）表示晚期凋亡細(xì)胞，右下象限（Q3）表示早期凋亡細(xì)胞，左下象限（Q4）表示正常的細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（RT-qPCR）檢測(cè)FLT3、NF-κB基因表達(dá) 實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組（含有1‰DMSO溶劑）和實(shí)驗(yàn)組（4 nmol/L、8 nmol/L PTX），處理48 h后，收集MOLM-13細(xì)胞，用trizol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s；60℃退火、延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列：GAPDH上游：5’-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3’，下游：5’-TAAAAAGCAGCCCTGGTGAC-3’；FLT3上游：5’-GCAATCATAAGCACCAGCCAGGAG-3’，下游：5’-TTCTGCGAGCACTTGAGGTTTCC-3’；NF-κB上游：5’-CCCGTGGTATCAGACGCCAT-3’，下游：5’-TCCTCCCCTCCAGTCACACA-3’。

1.7 Western blotting法檢測(cè)FLT3、NF-κB蛋白表達(dá)

收集MOLM-13細(xì)胞，PBS洗滌，按比例加入RIPA（10μg/mL）裂解液和蛋白酶抑制劑，置于冰上充分裂解30 min后，4℃、12 000 r/min離心20 min，小心吸取上清液，為總蛋白液。采用BCA試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。蛋白上樣后，十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳2～3 h，濕法恒流轉(zhuǎn)膜1～2 h，封閉液封閉30 min。一抗（FLT3、NF-κB、p-NF-κB）稀釋倍數(shù)1∶1 000，4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，每次8 min；二抗[辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔IgG]稀釋倍數(shù)1∶5 000，室溫孵育1～2 h，TBST漂洗3次，每次8 min；滴加ECL發(fā)光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用Image J軟件對(duì)各蛋白條帶灰度值進(jìn)行定量分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析以及半數(shù)抑制濃度（IC50）計(jì)算，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTX對(duì)MOLM-13和THP-1細(xì)胞增殖的影響

通過CCK8檢測(cè)不同濃度不同時(shí)間的PTX處理后MOLM-13和THP-1細(xì)胞活性，不同濃度的PTX作用于MOLM-13和THP-1細(xì)胞后，細(xì)胞存活率均有下降，呈劑量和時(shí)間依賴性，見圖1。其中，PTX作用于MOLM-13細(xì)胞24 h、48 h、72 h的IC50分別為7.659 nmol/L、3.748 nmol/L、3.408 nmol/L；而PTX作用于THP-1細(xì)胞24 h、48 h、72 h的IC50分別為61.164 nmol/L、11.804 nmol/L、9.834 nmol/L。

圖1 不同濃度PTX作用不同時(shí)間對(duì)MOLM-13和THP-1細(xì)胞增殖的影響

2.2 PTX對(duì)MOLM-13和THP-1細(xì)胞凋亡的影響

不同濃度的PTX（0 nmol/L、4 nmol/L、8 nmol/L）作用MOLM-13和THP-1細(xì)胞。PTX處理后的MOLM-13細(xì)胞凋亡率、早期凋亡率均高于對(duì)照組（0 nmol/L PTX組）（P＜0.05）。而4 nmol/L PTX處理后的THP-1細(xì)胞凋亡率、早期凋亡率與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；8 nmol/L PTX處理后的THP-1細(xì)胞凋亡率、早期凋亡率升高（P＜0.05），見表1。且相同濃度的PTX作用下，4 nmol/L PTX組、8 nmol/L PTX組中MOLM-13細(xì)胞的凋亡率、早期凋亡率均高于THP-1細(xì)胞（均P＜0.05），見圖2。

圖2 不同濃度PTX作用48 h對(duì)MOLM-13和THP-1 細(xì)胞凋亡的影響

表1 不同濃度PTX處理48 h對(duì)MOLM-13和THP-1細(xì)胞凋亡的影響

表1 不同濃度PTX處理48 h對(duì)MOLM-13和THP-1細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.3 PTX作用MOLM-13細(xì)胞株后對(duì)FLT3、NF-κB基因的影響 不同濃度的PTX（0 nmol/L、4 nmol/L、8 nmol/L）作用MOLM-13細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組（0 nmol/L PTX組）相比，實(shí)驗(yàn)組（4 nmol/L、8 nmol/L PTX）FLT3mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，且隨著PTX劑量的增加而降低（P＜0.05），見圖3。4 nmol/L的PTX作用MOLM-13細(xì)胞48 h后，NF-κBmRNA相對(duì)表達(dá)量無明顯變化，而8 nmol/L的PTX作用MOLM-13細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組（0 nmol/L PTX）相比，NF-κBmRNA相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.01），見圖3。

圖3 PTX對(duì)MOLM-13細(xì)胞FLT3、NF-κB基因表達(dá)的影響

2.4 PTX作用MOLM-13細(xì)胞株后對(duì)FLT3、NF-κB及p-NF-κB蛋白表達(dá)的影響PTX作用于MOLM-13細(xì)胞48 h后FLT3蛋白表達(dá)量與對(duì)照組（0 nmol/L PTX組）相比降低（P＜0.05）。4 nmol/L的PTX作用MOLM-13細(xì)胞48 h后NF-κB蛋白表達(dá)量無明顯變化，而8 nmol/L的PTX作用MOLM-13細(xì)胞48 h后，與0 nmol/L PTX組相比，NF-κB蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05），見圖4。4 nmol/L與8 nmol/L PTX作用于MOLM-13細(xì)胞48 h后，兩組細(xì)胞p-NF-κB蛋白表達(dá)量與對(duì)照組（0 nmol/L PTX組）相比均降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 不同濃度PTX處理48 h對(duì)MOLM-13細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

3 討論

近年來，隨著造血干細(xì)胞移植技術(shù)的成熟應(yīng)用和靶向藥物進(jìn)入臨床，AML的治療取得了很多新的突破。FLT3抑制劑如索拉菲尼、米朵妥林、奎扎替尼等均在復(fù)發(fā)/難治性AML的治療中顯示出了顯著的臨床效果[10]。一項(xiàng)研究表明，采取同種異體造血干細(xì)胞移植和FLT3抑制劑治療的FLT3-ITD突變陽性的AML患者，有更大的比例在連續(xù)幾年內(nèi)達(dá)到完全緩解，相應(yīng)的中位生存期和中位復(fù)發(fā)時(shí)間延長[11]。但同時(shí)也有研究表明，F(xiàn)LT3-ITD突變陽性的AML患者即使進(jìn)行了異基因造血干細(xì)胞移植，復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)也很高[12]。而FL3抑制劑治療也面臨著單藥抗性小、耐藥等問題[10]。耐藥與復(fù)發(fā)仍是FLT3-ITD陽性AML治療中存在的難題，尋找和嘗試新的有效的治療藥物是提高療效的關(guān)鍵。

PTX是一種微管穩(wěn)定劑，其主要作用機(jī)制是通過誘導(dǎo)和促進(jìn)微管蛋白聚合、抑制微管解聚、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯及促進(jìn)凋亡。有研究表明，PTX可誘導(dǎo)原代慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的凋亡[8, 13]。本研究將PTX應(yīng)用于AML細(xì)胞MOLM-13和THP-1，結(jié)果顯示PTX可抑制MOLM-13和THP-1細(xì)胞生長，且發(fā)現(xiàn)24 h、48 h、72 h PTX對(duì)FLT3-ITD突變陽性的細(xì)胞株MOLM-13的IC50均小于該突變陰性的THP-1細(xì)胞株。相較于THP-1細(xì)胞，PTX誘導(dǎo)MOLM-13細(xì)胞凋亡，且隨著PTX濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，說明PTX能特異性地抑制MOLM-13細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)凋亡。同時(shí)本課題組也證實(shí)了PTX還能抑制FLT3基因和蛋白的表達(dá)，可以推測(cè)PTX對(duì)FLT3突變存在特異性的作用。本課題組前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)PTX能抑制MOLM-13細(xì)胞增殖，且與抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的活性有關(guān)。而PI3K/AKT和（或）RAS/MEK/MAPK通路的激活，以及FLT3介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的持續(xù)表達(dá)是FLT3激酶抑制劑耐藥的機(jī)制之一[14]。

NF-κB是廣泛存在于各種類型細(xì)胞中的一種轉(zhuǎn)錄因子，其被發(fā)現(xiàn)在許多實(shí)體腫瘤和血液惡性腫瘤中異常激活，使得腫瘤細(xì)胞異常增殖和耐藥[15]。在AML中，F(xiàn)LT3-ITD突變或過表達(dá)FLT3會(huì)激活NFκB，使得NF-κB成組性地與DNA結(jié)合[16-17]。而在本實(shí)驗(yàn)中，8 nmol/L的PTX能降低MOLM-13細(xì)胞中NF-κB基因和蛋白的表達(dá)，4 nmol/L PTX可能是由于時(shí)間或劑量的關(guān)系沒有發(fā)揮抑制作用；同時(shí)PTX也能抑制MOLM-13中磷酸化NF-κB蛋白的表達(dá)，可以推測(cè)PTX是通過抑制NF-κB通路，從而抑制MOLM-13細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)其凋亡的。

綜上，PTX對(duì)FLT3-ITD突變陽性AML細(xì)胞株存在抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，其誘導(dǎo)凋亡作用是通過抑制FLT3和NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)。該研究為PTX治療AML提供了理論基礎(chǔ)，有望提高FLT3-ITD突變陽性AML的治療效果，為AML化療聯(lián)合藥物提供了新的思路。今后擬將PTX應(yīng)用于荷瘤小鼠以及AML原代細(xì)胞中，進(jìn)一步闡明其對(duì)FLT3-ITD突變陽性AML的體內(nèi)、外抗腫瘤作用，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。