血清H2S水平與絕經后女性骨質疏松性脊柱骨折愈合的相關性分析*

湯 波,陳 演,黃 濤

1.文昌市人民醫院運動醫學科，海南文昌571300；2.海南醫學院第一附屬醫院骨科，海南海口 570102

骨質疏松是絕經后女性人群最常見的骨代謝紊亂性疾病，與脊柱或髖骨骨折風險高有關[1]。無畸形愈合和盡快恢復肢體功能是骨折治療的目標。迄今為止，骨折愈合的詳細病理生理機制尚未完全澄清。以往的研究表明，破骨細胞的活化和成骨細胞的失活共同促進各種骨疾病的發展和骨折愈合進展，而這個過程受到多種細胞因子的調節例如硫化氫(H2S)[2-3]。H2S是一種普遍存在的氣體遞質，在骨轉化和骨代謝過程中發揮著重要作用[4]。據研究報道，H2S能夠降低尼古丁或脂多糖誘導的破骨細胞分化和破骨細胞祖細胞分化，在骨愈合過程中減少壞死性骨吸收，但有利于骨質疏松癥。此外，H2S還會降低骨質中基質金屬蛋白酶的活性，從而加速骨質礦化；或者通過減少糖皮質激素的分泌、抑制糖皮質激素受體α的活性來拮抗骨折后鈣、磷的流失等[5]。鑒于H2S在骨代謝和骨重建中的重要性，本研究旨在初步探討血清H2S水平與絕經后女性骨質疏松性脊柱骨折愈合之間的關系，從而為明確H2S在促進骨折愈合中的治療潛力提供臨床證據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2020年6月在文昌市人民醫院(簡稱“本院”)收治的112例脊柱骨折的女性患者，經診斷均屬于新鮮骨質疏松性椎體骨折(OVF)作為OVF組，OVF組楔形骨折76例、凹陷/雙凹陷骨折36例，未見壓縮性骨折。OVF組另根據骨折后4個月時的復查情況，分為骨愈合組32例、骨不愈合組80例。納入標準：(1)年齡≥50歲且絕經超過1年的女性；(2)均進行雙能X線吸收法(DXA)骨密度(BMD)檢查和生化指標測定；(3)椎體骨折經影像學檢查和磁共振顯像確診，且無椎弓根破壞、椎體后緣骨皮質完好。排除標準：(1)因高能量損傷(車禍等)造成的骨折或為繼發性骨質疏松、原發性及轉移性腫瘤引起的病理性脊柱骨折；(2)可能影響骨代謝的疾病患者，如轉移性骨癌、原發性甲狀旁腺功能亢進、甲狀腺功能障礙、多發性骨髓瘤、骨軟化、腎功能障礙、全身性感染疾病、口服藥物(包括糖皮質激素、性激素、華法林和雙膦酸鹽等)；(3)精神疾病。在本院健康體檢中心招募100例無精神類疾病、無低能量骨折、無中風病史、無骨質疏松明確證據的絕經后女性人群100例作為對照組1；另選取同期因跌倒入院檢查，且無精神類疾病、無低能量骨折、無中風病史的絕經后骨質疏松女性人群106例作為對照組2。OVF組均接受球囊擴張椎體后凸成形術等手術治療及常規藥物治療。3組在性別、年齡和骨密度比較，差異無統計學意義(P>0.05)。各組均有社會人口統計學、人體測量學數據，臨床診斷、合并癥、在急診48 h內的實驗室數據(包括骨代謝標志物、血清H2S等基線評估)，且對OVF組進行了為期1年的隨訪。本研究通過了本院倫理委員會的批準。

1.2方法

1.2.1血清骨轉換標志物和H2S水平檢測 OVF組在本院急診室隔夜禁食后采集血樣。對照組1和對照組2同樣采集空腹靜脈血樣本。樣品立即離心，在-80 ℃下保存，直至用于酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測。采用全自動電化學發光系統(Copas6000型、德國羅氏診斷公司)測定了血清骨轉換標志物，包括β膠原降解產物(β-CTX)、血清1型前膠原氨基端肽(P1NP)。另外應用改良亞甲基藍法測定H2S，即在血清樣品中加入Zn2+用于沉淀H2S、HS-、S2-及血漿蛋白，然后用氫氧化鈉重新溶解血漿蛋白。使用N,N-二甲基對苯二胺重新溶解沉積的ZnS，使用三氯乙酸沉淀殘余蛋白，在4 ℃環境下以12 000×g轉速離心5 min，取上清液加入10%硫酸鐵銨充分振蕩后，室溫靜置5～15 min生成亞甲基藍，分光光度計在665 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線，檢測血清H2S水平。所有的實驗室評估都是在骨折后2 d內進行的，并在骨折后4 d、7 d、14 d、1個月、2個月、12個月時分別檢測骨愈合情況及血清β-CTX、P1NP、H2S水平。

1.2.2BMD測定 使用GE Lunar iDXA(Hologic公司，軟件版本為16.0版，美國)進行DXA掃描，用于BMD評估，并記錄腰椎(L1～L4) 、股骨頸的T和Z值，如果OVF患者接受腰椎手術，將排除受累椎骨，在分析中考慮上或下非受累椎骨。2016—2020年使用GE Lunar iDXA通過對同一丙烯酸包覆的鋁脊柱L1～L4掃描>300次，以達到質量控制，變異系數(CV)<1%。同時為減少評估差異性，各組均由經過培訓的專業醫生按標準化程序進行，骨質疏松定義為T值≤-2.5標準差(s)，骨質減少定義為-2.5s

1.2.3骨愈合評估 在骨折后4個月時評估OVF組患者骨折愈合情況。脊椎活動度為X線測量的坐位與仰臥位之間椎體前緣高度變化。當OVF組脊椎活動度≤1.0 mm，且X線顯示仰臥位無椎內裂隙視為骨折愈合。

2 結 果

2.13組臨床資料比較 3組年齡、體質量指數(BMI)、絕經年齡、絕經時間、吸煙史、飲酒史、糖尿病史、高血壓史、高脂血癥史、冠心病史占比比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；但OVF組骨折后2 d血清P1NP、H2S水平高于對照組1和對照組2，OVF組骨折后2 d血清β-CTX水平、腰椎BMD及股骨頸BMD低于對照組1和對照組2，差異有統計學意義(P<0.05)；對照組2血清P1NP、H2S水平高于對照組1，腰椎BMD及股骨頸BMD則低于對照組1,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組臨床資料比較

組別飲酒史占比[n(%)]糖尿病史占比[n(%)]高血壓史占比[n(%)]高脂血癥史占比[n(%)]冠心病史占比[n(%)]對照組115(15.00)18(18.00)36(36.00)45(45.00)16(16.00)對照組221(19.81)19(17.92)46(43.40)52(49.06)21(19.81)OVF組26(23.21)27(24.11)43(38.40)47(41.96)24(21.43)F/χ2/H2.2811.7051.2411.1101.045P0.3200.4260.5380.5740.593

組別β-CTX [M(P25,P75),ng/mL]P1NP[M(P25,P75),ng/mL]腰椎BMD(x±s,g/cm2)股骨頸BMD(x±s,g/cm2)H2S(x±s,μmol/L)對照組10.48(0.41,0.70)29.20(19.86,41.35)1.19±0.231.06±0.318.97±2.20對照組20.66(0.52,0.85)a31.60(23.75,47.14)a1.04±0.29a0.96±0.24a16.55±8.05aOVF組0.77(0.58,0.93)a38.19(29.34,67.87)ab0.93±0.29ab0.69±0.22ab28.39±7.22abF/χ2/H8.794-7.82324.10559.256246.205P0.0010.009<0.001<0.001<0.001

2.2OVF組血清H2S水平與骨折潛在危險因素的相關性 經Pearson相關分析，OVF組骨折后2 d血清H2S水平與血清β-CTX(r=0.342，P<0.001)和P1NP(r=0.505，P<0.001)水平呈正相關，而與股骨頸BMD呈負相關(r=-0.602，P<0.001)，但是與其年齡(r=-0.149，P=0.260)、BMI(r=-0.281，P=0.076)均無相關性。使用多元線性回歸模型分析，進一步校正其他混雜因素后，發現骨折后2 d血清H2S水平是股骨頸BMD的獨立預測因子(β=0.462，P=0.002)。

2.3OVF組血清H2S水平變化 OVF組骨折后7 d血清H2S水平[(56.19±14.40)ng/mL]與其骨折后2 d血清H2S水平[(28.39±7.22)ng/mL]比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與骨折后2 d血清H2S水平比較，OVF組骨折后4 d血清H2S水平升高至40.08%，骨折后7 d血清H2S水平百分比升高至97.92%。OVF組骨折后14 d、1個月、2個月血清H2S水平比骨折后2 d血清H2S水平略有升高，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 隨訪期間OVF組血清H2S水平變化

2.4兩組不同時間點血清H2S水平比較 兩組不同時間點血清H2S水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；兩組骨折后7 d血清H2S水平高于其他時間點，差異有統計學意義(P<0.05)。骨不愈合組各時間點血清H2S水平均低于骨愈合組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組不同時間點血清H2S水平比較

2.5單因素和多因素Logistic回歸分析影響絕經后女性骨質疏松性脊柱骨折患者骨折愈合情況的臨床因素 經單因素和多因素Logistic回歸分析，骨折后7 d血清H2S水平是絕經后女性骨質疏松性脊柱骨折患者骨折愈合受損的獨立影響因素(P<0.05)。見表3。

表3 單因素和多因素Logistic回歸分析影響絕經后女性骨質疏松性脊柱骨折的骨折愈合情況的臨床因素

續表3 單因素和多因素Logistic回歸分析影響絕經后女性骨質疏松性脊柱骨折的骨折愈合情況的臨床因素

3 討 論

女性絕經后極易患有骨質疏松癥，骨質疏松癥易并發脊柱、髖部等部位骨折，并且骨質疏松在增加絕經后女性骨折風險的同時，也增加了骨折愈合的難度。脊柱骨折不愈合可導致椎體前柱進行性縮短，加重患者胸腰椎后凸畸形，使患者產生持續性腰背疼痛、平衡能力及活動障礙等癥狀，嚴重影響著患者的生存質量[6-7]。目前臨床已發現H2S在骨代謝及骨轉化中起重要作用，影響著患者骨折愈合。本研究對比了發生骨質疏松性脊柱骨折絕經后女性患者及未發生骨折的絕經后女性的血清H2S水平。盡管OVF組骨折后2 d血清H2S水平與β-CTX、P1NP水平、股骨頸BMD都有一定的相關性，但進一步校正其他混雜因素后，骨折后7 d時血清H2S水平仍然是預測絕經后女性骨質疏松性脊柱骨折患者骨折愈合受損的獨立影響因素，說明血清H2S水平影響著絕經后女性BMD。

骨質疏松癥的發生是因骨吸收與骨形成之間的不平衡，其特征表現為骨量低、骨微結構破壞，致使骨脆性增加、骨強度降低[8]。老年人群因機體代謝功能的衰退，常發生骨代謝異常，因此骨質疏松在老年人群中的發生率更高，此外女性絕經后卵巢功能不斷衰退，雌激素水平降低，導致女性骨質疏松發生率顯著高于男性[9]。而且雌激素缺乏會增強炎性細胞因子的表達，從而抑制成骨細胞的活性及分化，同時刺激破骨細胞活性、減少細胞凋亡，不僅增加骨質疏松癥的發生風險；而且也會導致骨強度降低、骨脆性增加[10-11]。因此絕經后女性極易發生骨質疏松性骨折。本研究中OVF組患者的腰椎、股骨頸BMD也明顯低于對照組患者，同時血清P1NP水平高于對照組，說明低BMD和高P1NP可能為絕經后女性更易在低能量損傷下發生骨折。不管年齡和健康狀況如何，骨轉換包括骨吸收和骨形成兩個過程。在骨吸收過程中，破骨細胞會在骨骼的不同部位移除少量的骨質，從而形成骨吸收腔。這個過程持續4～6周，在此期間，骨組織成分被分解并釋放到骨微環境中，并進一步進入循環血液和尿液。因此血液和尿液中骨組分或分解代謝產物的數量(如β-CTX)反映了骨吸收活性[12]。隨后，成骨細胞到達新形成的凹陷處開始骨形成。成骨細胞分泌骨樣分子(例如P1NP)填充空腔，這是一種富含膠原蛋白的結締組織，這些分子被釋放到循環系統中。血液中成骨細胞釋放的分子濃度(骨形成標志物)反映了骨形成活動[13]。

H2S是一種氣體遞質，內源性H2S主要由胱硫氨酸γ-裂解酶(CSE)、胱硫醚-β合成酶(CBS)在轉硫作用中產生，有研究通過對人BM基質細胞使用17b-雌二醇進行體外處理，發現雌激素可上調CBS及CES的水平，進而生成H2S，這可能與絕經后女性患骨質疏松癥相關[14]。這也解釋了為何在本研究中對照組絕經后骨質疏松女性人群血清H2S水平較非骨質疏松對照女性人群普遍升高。H2S被證明可通過多途徑參與骨組織再生及修復過程，既往研究認為H2S對骨折愈合有積極意義[15]，如H2S抑制活性氧信號的直接和間接機制是通過觸發核因子E2相關因子2依賴的抗氧化反應，從而抑制破骨細胞分化，并且在缺氧、氧化性損傷等應激狀態下，H2S可增加骨髓間充質干細胞及其他類型細胞的增殖及活性。ZHENG等[16]發現CSECSE-H2S系統通過硫化作用提高了runt相關轉錄因子2的活性，從而促進骨基質形成和骨折愈合；BEHERA等[14]也提到CBS缺乏型小鼠血清及細胞內H2S水平降低，致使小鼠發生嚴重骨質疏松癥。本研究OVF組骨折后2 d血清H2S水平與β-CTX、P1NP水平、股骨頸BMD都有一定的相關性，說明在骨折早期H2S應激性合成增加，并且積極參與了骨轉化過程。MA等[5]曾證實過H2S對糖皮質激素導致的繼發性骨質疏松癥大鼠的治療作用，其研究團隊認為外源性H2S通過激活Wnt/β-catenin信號通路，減弱了地塞米松誘導的成骨細胞增殖和成骨分化的抑制作用，同時還能保護成骨細胞的活性，防止地塞米松誘導的細胞凋亡。本研究兩組骨折后7 d血清H2S水平高于其他時間點，且骨不愈合組在各時間點血清H2S水平均低于骨愈合組，說明內源性血清H2S水平在骨折早期應激性升高對促進骨折愈合有積極意義。而且經單因素和多因素Logistic回歸分析證實了骨折后7 d時血清H2S水平是絕經后女性骨質疏松性脊柱骨折患者骨折愈合受損的獨立影響因素。

綜上所述，血清H2S水平與絕經后女性骨質疏松性脊柱骨折患者骨折愈合情況有一定相關性，內源性H2S升高可促進骨組織的再生及修復，有利于骨折愈合。絕經后女性發生骨質疏松性脊柱骨折后7 d血清H2S的低水平可能是增加患者發生骨折愈合受損風險的重要因素。建議對血清H2S水平進行深入研究，為改善絕經后女性骨折愈合提供更佳治療方案。