典型拉曼光譜技術及其在農業檢測中應用研究進展

摘要：拉曼光譜是一種散射光譜，具有快速、不易受水分干擾、樣品無需預處理和在體檢測等特點，可作為分析、測試物質分子成分和結構強有力的表征手段。隨著拉曼光譜技術的不斷發展，其在農業檢測領域中逐漸發揮出極其重要的作用。本文概述了拉曼光譜的檢測原理，從共聚焦顯微拉曼光譜、傅里葉變換拉曼光譜、表面增強拉曼光譜、針尖增強拉曼光譜、共振拉曼光譜、空間偏移拉曼光譜、移頻激發拉曼差分光譜、基于非線性光學的拉曼光譜等8個方面介紹了拉曼光譜技術，重點總結了拉曼光譜技術在植物檢測、土壤檢測、水質檢測、食品檢測等方面的應用研究進展，并提出了其在農業檢測領域中應用需要解決的難題和未來的發展方向，以期對未來農業生產和研究帶來啟發。

關鍵詞：拉曼光譜;植物表型;植物脅迫;土壤檢測;農藥殘留檢測;水質檢測;食品檢測

中圖分類號：O657.37;S-1""""" 文獻標志碼：A"""""""" 文章編號：SA202201013

引用格式：高振， 趙春江， 楊桂燕， 董大明.典型拉曼光譜技術及其在農業檢測中應用研究進展[J].智慧農業（中英文）， 2022， 4（2）：121-134.

GAO Zhen， ZHAO Chunjiang， YANG Guiyan， DONG Daming. Typical Raman spectroscopy technology and re‐ search progress in agriculture detection[J]. SmartAgriculture， 2022， 4（2）：121-134.（in Chinese with English abstract）

1引言

農業是與人類生活息息相關的產業，是國民經濟的重要支柱。智慧農業需要更為快速、先進、準確的傳感器來獲取動植物的表型特征，讓農業生產更加“聰明”和“智慧”[1]。農業產業鏈中面臨著種種問題：在農產品生產、收獲、加工以及銷售的一系列流程中，農作物的生長狀況、農產品的產量及加工流程等均需要進行實時監測;農藥的使用可能導致農產品存在農藥殘留，威脅人類健康;在食品加工過程中，廠家為了提升經濟利益而在食品中摻假的情況時有發生。傳統的檢測手段需要對樣品進行前處理，耗時、費力、破壞樣品，運用快速、無損、在線的測量方法來解決上述農業中的監測和檢測難題成為熱點。

1928年，印度科學家 C.V. Raman 發現了光的非彈性散射現象，稱為拉曼效應[2]。拉曼光譜是基于激發光譜和待測分子之間的拉曼效應所獲得的光譜。拉曼光譜測量分子的振動與轉動，拉曼頻移大小與入射光源波長無關，通過譜峰的位置可反映被測物質分子的官能團或化學鍵的特征振動頻率。因此，拉曼光譜被稱為“分子指紋”。作為一種強有力的分子檢測手段，拉曼光譜技術可實現樣本快速、無損檢測[3-5]。此外，水分子的拉曼散射效應較弱，在測量中，拉曼光譜不易受水分子的干擾。這使得拉曼光譜能夠用于含水生命體的測量[5]。拉曼光譜的測量原理如圖1所示。

本文從拉曼光譜的測量原理出發，總結了8種典型拉曼光譜技術的原理和優缺點，重點介紹了拉曼光譜在農業檢測中的研究進展，并分析了存在的問題和未來發展方向。

2典型拉曼光譜技術概述

拉曼光譜的信號非常微弱，受散射光強度低的影響，在過去很長一段時間內拉曼光譜的發展十分受限。直到1960年激光技術興起后，拉曼光譜儀以激光作為光源，才得以使散射信號強度大幅提高，拉曼光譜技術才得以迅速發展。隨著激光技術、光學元器件制作工藝、電子設備、納米科技、計算機技術的成熟和不同研究需求的促進，拉曼光譜已經成為具有多種測量形式的分析技術。本節將介紹8種典型的拉曼光譜技術。

2.1共聚焦顯微拉曼光譜技術

共聚焦顯微拉曼光譜是將共聚焦技術、拉曼光譜技術、顯微技術三者相融合，能夠在微米級尺度的空間中對樣品進行拉曼高光譜成像，實現對樣品的化學組成以及空間分布的同步分析[6]。共聚焦技術配置針孔，可在樣品 X軸、Y軸（橫縱向）和 Z （深度）軸上進行空間濾波，能夠有效地濾除雜散光，提高信噪比。因此，共聚焦顯微拉曼光譜技術成像清晰，具有高空間分辨率，已廣泛應用于生命科學領域微觀尺度的研究[6，7]。長焦拉曼光譜儀還具有很高的光譜分辨率，從而能夠區分更多物質的特征峰，應用于更為復雜的混合物質的檢測中。

共聚焦顯微拉曼光譜技術需要更為復雜的顯微結構和更大體積的光學腔室作為基礎，因此這一類拉曼光譜儀一般用于實驗室中的檢測和測量。且由于焦長較長，儀器需要較為嚴苛的環境（如溫度、濕度、振動等）來保證穩定性。同時因為顯微的拉曼光譜儀一般為色散分光系統，感光系統的材料為硅，因此常用的激發光波段為紫外和可見光區域。而紫外光的能量高，容易損傷生物樣本，所以常用可見光波段進行激發。這就導致了產生的熒光背景較高，從而促進了拉曼光譜熒光背景消除算法的使用和發展。

2.2傅里葉變換拉曼光譜技術

拉曼信號易受樣品中發色團熒光信號的干擾。傅里葉變換拉曼光譜是近紅外激發拉曼技術與傅里葉變換技術的結合，在 1986年由赫希Hirschfeld （非爾德）和 Chase （蔡斯）首次實際應用[8]。傅里葉變換拉曼光譜技術由于沒有經過光柵色散，這種技術的信噪比在其他測量參數相同的情況下一般高于色散型光譜儀。傅里葉變換拉曼光譜通常以1064 nm激光作為激發光源，可以極大地降低樣品的熒光信號，有效避免熒光對拉曼散射的干擾，提升拉曼光譜的信號強度和信噪比[9]。有研究者總結了將此項技術應用在食品領域的潛力研究[10]。近些年來，也有研究者將可見波段的激光與傅里葉光譜儀結合[11]，有望成為一種新的發展趨勢。

2.3表面增強拉曼光譜技術

表面增強拉曼效應最早由 Fleischmann 等[12]在1974年發現，它推動了增強拉曼光譜技術的研究。表面增強拉曼光譜技術（ Surface En ‐hanced Raman Spectroscopy ， SERS ）解決了自發拉曼光譜檢測靈敏度低的問題。當待測分子吸附在粗糙的金屬材料表面時，可使待測物的拉曼信號有效增強。其增強機制可分為物理增強和化學增強[13]。SERS活性基底的制備是獲得增強拉曼信號的前提條件，只有金、銀、銅等少數金屬基底才具有很強的 SERS效應。隨著納米科技的發展， SERS 基底的制備方法取得了巨大的進步。不同的增強基底對樣品的增強效果差別很大，因此針對特定分析物研制合適的基底有利于提高檢測靈敏度和穩定性。比如對于痕量物質，需要在基底上涂有富集功能的材料以實現痕量物質的檢測;對于金屬親和性不強的待測物質，需要有核酸適配體等其他物質的修飾進行親和富集。

SERS 技術已經應用于植物中提取的激素等分子的分析檢測及植物病原體檢測等方面[14]。它的優勢在于具有很高的靈敏度，相比于自發拉曼光譜， SERS的光譜強度可以增強3～4個數量級，因此具有更低的檢測限。但是傳統的 SERS 技術穩定性較低，尤其是在定量分析中，難以獲得穩定的定量結果，同時，由于基板的光熱效應，容易損傷待檢測的生物分子，具有很低的生物相容性。因此，提升定性和定量的穩定性是下一步 SERS技術的發展方向。

2.4針尖增強拉曼光譜技術

普通顯微拉曼光譜技術由于光學衍射極限和探測器靈敏度的限制，很難直接應用于納米尺度表征。針尖增強拉曼光譜技術是將掃描探針顯微鏡與 SERS相結合，具有高靈敏度和高空間分辨率[15]。當入射光照射在納米尺度的尖銳金屬探針尖端時，在局域表面等離激元共振效應、避雷針效應和天線效應的共同作用下，針尖附近幾納米到十幾納米范圍內會產生強烈的局域電磁場增強，增強針尖下方樣品的拉曼信號[16]。通過掃描探針顯微鏡操作針尖在樣品上方的掃描，能夠實現樣品表面納米尺度的形貌表征和納米局域拉曼光譜同步探測。

針尖增強拉曼光譜技術已經應用于檢測 RNA序列[17]、農藥[18]、細菌、病毒等[19，20]等多個方面。這一技術的優勢是可以提供更高的空間分辨率，甚至可以達到納米級的空間分辨。可在分子水平上進行科學研究，為納米尺度的化學分析和成像開辟了新的可能。由于針尖區域的磁場增強，可以具有更高的靈敏度和更低的檢測限。測量穩定的結果需要制備外形尺寸一致、光學特性可精確控制、可長期保存并且使用的高質量TERS （Tip" Enhanced" Raman" Spectroscopy） 探針，但是當前的技術并不能完全達到這一要求。

2.5共振拉曼光譜技術

共振拉曼光譜是將激發光的能量調整到待測物電子躍遷能量附近以達到共振效果。但是共振激發波長一般位于紫外-可見光區域，因此共振拉曼光譜的熒光背景也會更加顯著，這種方法容易受到熒光的干擾[21-23]。

共振拉曼光譜技術已經成功應用于植物色素的檢測中，例如典型的類胡蘿卜素，在可見光區域使用532、514.4和488 nm 的激光都能夠產生共振增強的效果，信號強度可增強2～6個數量級，因此具有更高的靈敏度[24，25]。由于激發光譜能夠激發待測分子的電子能級躍遷，因此這一技術獲取的拉曼光譜通常伴有較強的熒光背景。采用預共振的激發光波長能夠減弱熒光背景，但是減弱的幅度有限。

2.6空間偏移拉曼光譜

空間偏移拉曼光譜技術（Spatial Offset Ra‐man Spectroscopy ， SORS ）是在樣品表面離開光源照射點一定位移處收集拉曼信號，位移越大，所得拉曼信號中更深層樣品的貢獻越多。傳統的背向散射拉曼光譜穿透深度很淺，只能獲得樣品表面的物質成分。透射式拉曼光譜是待測物內所有化學信息的表征，無法對不同深度位置點的信息進行反映，空間偏移拉曼為實現物質內部深層次化學信息非損傷性檢測提供了可能。

空間偏移拉曼光譜已經應用于鮭魚質量[26]和馬鈴薯塊莖營養成分的非侵入性和非破壞性評估[27]。這一技術的優勢是可以在不破壞樣品表層的情況下獲得樣品內部的物質成分信息，并對待測對象進行縱深方向上的成分分析，獲取深層次的化學信息。但是對于激發光譜吸收嚴重的樣品，會導致拉曼信號強度降低。同時相比于傳統的自發拉曼光譜技術，需要更高量子效率的電荷耦合元件（Charge-Coupled Device ， CCD ）和復雜的光路設計，從而成本造價更高[28]。

2.7移頻激發拉曼差分光譜

移頻激發拉曼差分光譜是根據拉曼偏移與激發波長無關的特性，使用兩個相近的激發波長激發樣品獲取光譜后做差分，分析得出拉曼光譜的技術。這種技術能夠有效地降低測量的熒光背景，分析強度較弱的拉曼信號[29]。

這一技術已經應用在土壤成分檢測等方面[30]，因為其獨特的算法和光路的優勢，能夠大幅度降低熒光背景對拉曼信號的影響。但是這一技術需要雙波長激光進行激發，因此需要更為復雜的光路設計，甚至需要兩組光路，增加了系統的復雜性。

2.8基于非線性光學的拉曼光譜

基于非線性光學原理的兩種拉曼光譜手段也可用于提升信噪比，分別叫做相干反斯托克斯拉曼光譜[31]和受激拉曼光譜[32]。

目前，基于非線性光學的拉曼光譜技術主要集中在快速成像上，應用較少。現已有受激拉曼光譜應用于植物葉片的角質層及木聚糖等物質的成像分析[33]。相干反斯托克斯拉曼光譜技術也有應用于植物細胞壁的木質素的成像分析研究[34]。受激拉曼光譜由于雙光子共振效應增大了拉曼散射截面，提高拉曼激發效率，可以顯著地提升信噪比。相干反斯托克斯拉曼光譜技術能夠研究反斯托克斯散射，從而避免了熒光等其他因素的影響。兩種技術都具有很快的光譜成像速度。但是兩者的光學結構相對于自發拉曼光譜要復雜的多，甚至會用到飛秒激光器等設備，造價昂貴。以上所述拉曼光譜技術的優缺點對比如表1所示。

3拉曼光譜在農業檢測中的應用

拉曼光譜在農業主要領域檢測中的應用主要包括植物檢測、土壤檢測、水質檢測以及食品檢測等。其中，植物檢測包括植物表型研究和植物脅迫檢測，土壤檢測包括土壤農藥殘留檢測、土壤菌落檢測和土壤營養物質檢測，食品檢測包括食品農藥殘留檢測、食品品質檢測以及食品摻假檢測等。

3.1植物檢測

拉曼光譜技術具有“分子指紋”特性，能夠特異性識別生物分子，且不需要樣品制備。這滿足了對植物中特定分子及其含量在體鑒定和表征的需求，現已應用于植物表型研究和植物脅迫檢測。

3.1.1植物表型研究

拉曼光譜的植物表型包括植物的成熟程度、生物大分子物質的測量以及不同基因型的分類為植物育種提供指導等。

如何判斷植物生長階段是重要研究方向，在植物成熟的時候及時收獲有助于提高經濟效益。拉曼光譜可以用于檢測水果的成熟度， Khoda‐" bakhshian 等[35] 以開花之后88 d 到143 d 的四個明顯不同成熟階段的石榴作為樣本，基于傅里葉變換拉曼光譜進行分析，通過無監督算法主成分分析（Principal Components Analysis ， PCA ）將四種類型的石榴拉曼光譜區分開，采用有監督的算法偏最小二乘判別分析（Partial Least Squares" Discriminant Analysis ， PLS-DA ）和軟獨立模式分類法（Soft Independent Modeling of Class Anal‐" ogy ，SIMCA ）進行分類分析，其中 SIMCA可以達到82%的準確度，PLS-DA的訓練集和驗證集的準確度分別為96%和95%。當只采用“成熟”和“不成熟”兩種類別時，基于 PCA 的 SIMCA" 模型能夠達到100%的分類準確度。拉曼光譜還可以通過水果表面檢測內部的成熟程度， Qin" 等[36]探索了基于 SORS 無損評價番茄內部成熟度的方法，通過熒光校正后的偏移光譜的自建模混合分析，有效分離了外果皮層和特氟隆層的拉曼信號，檢測到番茄內部的類胡蘿卜素變化從而實現對番茄成熟度的區分。

拉曼光譜結合化學計量學方法能對植物品種進行分類。Morey 等[37]用 9個土豆品種進行實驗，由于土豆的顏色不同，散射光譜的強度也不同，將原始光譜標準化到1460 cm-1并用于之后的分析，用 SORS技術實現了對土豆的營養成分分析、品種鑒定和產地確定。Farber 等[38]基于正交偏最小二乘法法和籽粒的拉曼光譜實現95%的基因型區分準確度。研究還發現拉曼光譜可以用于檢測花生籽粒的營養含量（碳水化合物、蛋白質、纖維、油、不飽和脂肪酸），說明拉曼光譜可以根據花生葉子和種子的光譜特征準確識別花生品種，用于精準育種。Jentzsch等[39]對從不同省份采集的 National 和 CCN-51品種的可可豆樣品進行研究，每個可可豆在4個不同的樣品點測量，使用化學計量學處理光譜數據，區分品種總準確度為91.8%。同樣地，拉曼光譜可以確定6種不同的玉米以及它們各自的營養成分[40]。

拉曼光譜能夠對植物中所含有的生物大分子物質進行表征。張燕燕等[41]基于 SERS技術檢測了植物激素脫落酸，檢測限達到0.1μmol/L，該方法結果與酶聯免疫吸附劑測定（Enzyme LinkedImmunosorbent Assay ，ELISA）具有良好的吻合度。類胡蘿卜素作為植物的重要色素，引起了研究者們的廣泛研究。Schulz 等[42]研究了近紅外傅里葉變換拉曼光譜類胡蘿卜素原位研究中的獨特優勢。從多種植物組織中獲得的光譜表明，C=C 伸縮振動的波數位置主要受類胡蘿卜素多烯鏈的長度和末端取代基以及它們與其他植物成分的相互作用的影響。拉曼光譜可以用于在單細胞和多細胞層面對細胞壁中多糖進行成像分析，包括纖維素、半纖維素、果膠等物質，從而用于研究水果收獲后存放過程中的軟化機理，揭示在不同存放溫度下果肉軟化過程中的細胞壁成分分解過程[43]。木質素纖維生物質可以作為可再生能源，富含可與木質素共價鍵結合的多糖，拉曼光譜在植物木質素的研究中也有探索[44，45]。Oliveira等[46]用傅里葉變換紅外光譜和拉曼光譜表征植物細胞壁，發現 Coastcross 和 Tifton 85兩種草在酶法水解后有更低的木質素頷聯和更高的糖化，因此，拉曼光譜可以作為檢測不同草品種中木質素含量的重要手段。

根據上述可以得知，拉曼光譜可以用于植物的表型研究，尤其是專用的拉曼光譜傳感器，能夠更加方便快捷地現場獲取植物的表型數據，以供大數據分析。但是，拉曼光譜結合化學計量學方法的研究還需要進一步加強，和不同的機器學習算法的結合還有待探索，從而能夠對植物產地分類、成熟度分類等方面達到更高的準確率。

3.1.2植物脅迫檢測

植物脅迫包括非生物脅迫（光照、水分、鹽脅迫、溫度等）和生物脅迫（病害、蟲害等）。生長在脅迫狀態下的植物會導致生長狀態不佳，最終影響產量甚至死亡。因此，在脅迫的早期進行判別和鑒定能夠及時介入種植管理，能夠達到提升產量的目的。

拉曼光譜可以測量非生物脅迫。實時監測植物營養狀態能夠及時控制肥料的使用，提升產量和降低環境影響。Huang 等[47]對擬南芥、小白菜和菜心三種作物進行氮素監測，發現1046 cm-1 峰可以表征植物中的氮素狀態，可用于對缺氮植物在沒有任何可見癥狀前進行早期診斷氮素缺失。Sanchez等[48]使用便攜式拉曼光譜儀實現了水稻氮、磷、鉀的缺失癥狀的診斷，同時，他們還發現拉曼光譜可用于中高鹽脅迫癥狀的預診斷。便攜式夾葉傳感器能夠用于檢測植物受到的氮素缺失和干旱脅迫，Gupta等[49]證明其監測結果和實驗室臺式拉曼光譜儀測量的結果一致，為拉曼光譜用于植物早期疾病現場診斷和監測植物脅迫狀態提供了新工具。Zhao等[50]用共聚焦拉曼光譜掃描健康、早期缺鋅和缺鋅的水稻葉片，發現缺鋅導致葉片中類胡蘿卜素含量上升，其他成分如淀粉、蛋白質、糖類、氨基酸下降，結合最小二乘支持向量機模型建模分析，對三種葉片樣品實現100%區分。

拉曼光譜不僅用于非生物脅迫，在生物脅迫方面，它也能夠在早期發現脅迫導致的植物生理狀態的改變。Sanchez等[51]使用拉曼光譜觀察到了來自豇豆綠豆象幼蟲及其排泄物影響的光譜的變化，表明化學計量學與拉曼光譜相結合能夠較準確地區分未受侵染的種子和受侵染的種子。該團隊還用便攜式拉曼光譜對番茄上 Liberibacter疾病的非侵入性診斷，達到80%的準確率[52]。

在植物病原體診斷領域傳統的“黃金標準”是定量聚合酶鏈反應（quantitative Polymerase" Chain Reaction ， qPCR）技術。 Sanchez 等[53]對拉曼光譜表征植物遭受病害的有效性進行了驗證。通過利用 qPCR技術對柑橘樹的黃龍病進行早期對比診斷，發現拉曼光譜不僅能夠預測早期黃龍病感染，還發現光譜中表現出了 qPCR陰性植物的黃龍病特異光譜特征，可以與不相關的營養缺乏的植物區分開。因此，拉曼光譜對于黃龍病的診斷更加敏感。Lin等[54]也使用 SERS檢測了香蕉枯萎病的致病菌和感染枯萎病的香蕉假莖，實現無癥狀感染樣品76.2%的檢出率，和逆轉錄-聚合酶鏈反應技術檢測效果相似。代芬等[55]基于自熒光光譜、拉曼光譜和混合光譜三種光譜的 PLS-DA模型鑒別柑橘健康樣本和黃龍病樣本的準確率分別為86.08%、 98.17%和94.75%，拉曼光譜模型的鑒別效果最優。

拉曼光譜在植物重金屬脅迫和納米離子污染脅迫中也有研究。Timchenko 等[56]基于拉曼光譜成功研究了土壤中的銅離子濃度變化對于植物光學特性的影響。

3.1.3小結

拉曼光譜用于植物表型研究和植物脅迫狀態的檢測現已取得了廣泛關注和研究。通過拉曼光譜進行植物脅迫狀態的判斷能夠快速便捷且無需樣品制備地給生產實踐的環境調控提供指導意見。雖然拉曼光譜是“分子指紋”光譜，但是對于不同的植物脅迫類型，比如生物脅迫和非生物脅迫兩個大類的甚至于更精細脅迫的區分研究還處在發展之中。

3.2土壤檢測

拉曼光譜應用于土壤領域的研究主要有土壤農藥殘留檢測、土壤菌落檢測和土壤營養物質檢測三個方面。

3.2.1土壤農藥殘留檢測

拉曼光譜可以用于土壤中農藥的殘留檢測。Zhang等[57]首次提出用 SERS檢測土壤中的福美雙（ Thiram ），但需要離心提取樣品，添加劑誘導福美雙在納米顆粒（ NPs ）上吸附，實驗過程復雜繁瑣，不利于快速、簡便地分析。為了在復雜的基體中進行現場測量，Lin等[58]研發了一種基于紙基分離技術的表面增強拉曼光譜基底用于測量土壤中的福美雙。這種紙基傳感器可以獲得0.56×105的增強因子，在點到點的拉曼強度變化低至12.8%，具有出色的重復性，不用任何預處理可以實現土壤中福美雙的定量檢測。

拉曼光譜對噻菌靈（ Thiabendazole ）、撲草凈（Prometryn）、阿特拉津（ Atrazine ）[59，60]等不同種類的農藥檢測也同樣有效。這些研究說明拉曼光譜可以用于土壤中農藥殘留的檢測。

3.2.2土壤菌落檢測

拉曼光譜可以用于檢測土壤中的菌落。生物固氮是將惰性氮氣（ N2）轉化為生物可利用氮（氨或硝酸鹽）的關鍵過程。D2O 同位素標記的單細胞拉曼光譜可以用于檢測土壤中的溶磷菌，并且可以將 C-D帶的強度在 C-H和 C-D帶的比例作為磷釋放量的半定量生物指標[61]。" Schwarz 等[62]介紹了一種使用聚乙烯亞胺（ PEI ）改性聚乙烯顆粒從復雜土壤樣品中分離各種細菌的快速簡單的策略，從土壤中分離出來的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、熒光假單胞菌、鏈霉菌和酸鏈霉菌等可以用拉曼光譜結合化學計量學方法達到92%的識別率。

3.2.3 土壤營養物質檢測

拉曼光譜可以用于檢測土壤中的水溶性氮。準確和快速測定土壤中的水溶性氮對于科學施肥有很大幫助。" Dong 等[63] 使用 SERS 和 Opto Trace Raman 202（ OTR202）基底實現對土壤中水溶性氮的定量檢測。研究發現，所用 SERS基底的增強效應要強于金納米基底和銀納米基底。用 PLS對一次微分處理過的原始光譜進行建模所獲得的預測準確度最高 （Rp2 =0.91，RMSEp =8.76 mg/L ，RPD =3.00）。1028、1370、1436和1636 cm?1都是水溶性氮的特征峰，其中1370 cm-1 特征峰的強度和水溶性氮濃度的關聯最高（ Rp2=0.94）。基于 PCA 和最小二乘支持向量機（ Least Squares" Supports Vector Machine ， LS-SVM ）對高水溶性氮含量（70.5～118.3 mg/L）和低水溶性氮含量 （22.7～63.7 mg/L）的土壤可以達到86.67%的區分，有助于科學精準施肥。磷是生命體新陳代謝的必需元素。Vogel 等[64] 在2013年用可見光拉曼顯微法測定土壤中的磷相態，但由于土壤中其他有機物質的熒光太強沒有分析土壤中的磷酸鹽相態，在之后實驗中用深紫外激光進行激發，避免了熒光的干擾[65]。

3.2.4 小結

拉曼光譜可以對土壤中的生物和非生命物質進行檢測，并且實現了土壤中農殘、菌落、氮磷等痕量物質的檢測。但是檢測過程比較復雜，一般基于 SERS 技術，需要基底增強。由于 SERS 基底的定量性差，這對定量研究的可靠性帶來了挑戰。開發更加穩定的 SERS基底適用于土壤的研究將會是一個發展方向。

3.3水質檢測

拉曼光譜可以用于檢測水質中的污染物，包括有機物、無機物和生物污染物等。

在水中重金屬和化學污染物檢測方面，Liu等[66]采用錳共沉淀法結合拉曼光譜法測定微量重金屬（銅、鋅、鎘、鉛），采用偏最小二乘回歸模型建立的銅、鋅、鎘、鉛的預測的相關系數可分別達到0.979、0.964、0.956和0.972，均方根誤差分別為6.587、9.046、9.998和7.751μg/kg，表明采用共沉淀法結合拉曼光譜法測定水中重金屬含量是可行的。金屬有機框架材料（ Metal-Or-ganic Frameworks ，MOF ）具有可調的多孔結構和出色的吸附能力，通過調節等離激元 MOF 的孔尺寸，可以有效地產生篩選效應，降低其他生物樣品的干擾。Hu等[67]用在 MIL-101里面嵌入金納米顆粒制作的新型 SERS底物實現環境水中對苯二胺（p-phenylenediamine） 的定量分析，在1～100 ng/mL之間的相關系數達到0.995。

對于水的農藥殘留檢測也有研究。直接用SERS 檢測自然污染的水存在非特異性共吸附問題，即水中的其他物質和待測物非特異性共吸附到金屬納米結構上。為克服這一問題，Mari?o-Lopez 等[68]用內部含有金納米顆粒的微孔二氧化硅膠囊作為 SERS底物進行檢測，這種微孔結構能夠作為分子篩阻止大生物分子和細胞到達等離激元部分，并且能夠使溶膠更穩定，使得滴滴涕（Dichlorodiphenyltrichloroethane）的檢測限可達到1.77μg/L。

拉曼光譜也可以用于水中細菌的檢測。Es-coriza等[69]評估了拉曼光譜作為水傳播病原體計數技術的適用性，選擇了2800～3000 cm-1之間觀察到的顯著的 C-H 伸縮帶用于光譜量化目的。通過過濾濃縮的樣品顯示出了拉曼光譜與其他定量方法之間的良好相關性，包括濁度（ R2=0.92）、平板計數（ R2=0.87）和干重（ R2=0.97）。拉曼光譜對于水的物理特性檢測也有相關研究。Yang等[70]采用拉曼光譜法對四種水樣的硬度指標進行了研究。結果表明，隨著水的總硬度的降低，水的彎曲振動強度與拉伸振動強度之比減小。這說明拉曼光譜可以直接測量水的總硬度，為水質分析提供了一種簡單有效的方法。由于拉曼光譜用于水質檢測存在優勢，這一課題引起了研究者廣泛關注。Li 等[71，72]對于拉曼光譜用于水質檢測進行了總結和歸納，根據污染物的類型介紹了用于水質檢測的各種拉曼光譜技術，總結了各種拉曼光譜技術的優點和局限性。拉曼光譜也可用于水溫度檢測[73，74]。

由于拉曼光譜對于水不敏感，能夠直接用于檢測水溶液中的其他待檢測分子。面對水溶液中低濃度待測分子和實際水質成分復雜的問題，通過濃縮和特異性處理等方法手段與拉曼光譜結合可以為水質檢測提供更高的檢測靈敏度和檢測精度。但是由于水是透明基體，散射光不易被拉曼光譜儀收集，因此需要進一步研究，為拉曼光譜用于水質檢測提供理論基礎和實踐應用。

3.4食品檢測

拉曼光譜用于食品檢測主要集中在食品藥物殘留檢測、食品摻假檢測和食品品質檢測。"" 3.4.1食品藥物殘留檢測

果蔬上的農藥殘留嚴重威脅人類的健康安全，拉曼光譜可以用于檢測果蔬中的農藥殘留。聚乙烯醇修飾的金納米顆粒溶膠用于檢測水果和蔬菜中的福美雙殘留，將溶膠滴在被測量樣品表面，在蘋果、梨和蔬菜中檢測限可以分別達到4.62、7.83、10.74μg/L ，遠低于5μg/mL 的國家標準，同時可以使用比色法人眼觀察是否有福美雙殘留，通過 SERS技術進一步驗證，在實際應用中具有重要的意義[75]。拉曼光譜不僅可以用于單一農藥的測量，還可以更加適應實際情況，檢測混合農藥，減少農藥對人體的傷害， Hu 等[76] 提出一個無損傷和靈敏的方法，用 SERS 加界面自組裝金納米棒陣列襯底來測量基于拭子提取法回收的果實表面的福美雙和噻菌靈的混合物殘留，使用自建模混合分析（ Self-Modeling Mixture Analysis ，SMA ）方法可以同時實現兩個單成分的定性和定量分析，在蘋果、番茄、梨上檢測限針對福美雙分別達到0.041、0.029、0.047 ng/cm2，對于噻菌靈分別達到0.79、0.76、0.80 ng/cm2，表明 SERS檢測結合 SMA方法能夠在實際應用中提供多分析物檢測。Dhakal等使用拉曼光譜檢測蘋果上的毒死蜱，將677 cm-1的拉曼特征峰認定為毒死蜱的指紋光譜，峰強度與使用氣相色譜法獲得的實際農藥濃度相關，并建立了多元線性回歸（Multiple Linear Regression ， MLR ）預測模型，校準和驗證的相關系數分別為0.86和0.81[77]。食品上的農藥殘留由于對人體健康造成的巨大潛在威脅而引起了研究者們的廣泛關注。張莎等[78]使用 SERS 技術檢測臍橙果肉中的抑霉唑殘留，結合 PCA 和支持向量回歸（SupportVector Regression ， SVR ）算法的預測集 Rp 可高達0.9156; Tsagkaris 等[79] 匯總了2016—2020年的基于光學檢測的農藥殘留篩查方法，包括了自發拉曼光譜和表面增強拉曼光譜技術等。

肉類食品中的藥物等非食品添加劑也嚴重影響和威脅人類的身體健康。Zhao等[80]基于表面增強拉曼光譜測量鴨肉中四環素殘留，使用1272和1558 cm-1拉曼峰強的比值建立校準曲線，和鴨肉中提取物中的線性回歸方程的相關系數為0.950，相對標準偏差可以達到2.4%～2.6%，結果表明這是一種快速檢測鴨肉中四環素殘留的良好檢測方案。Girmatsion等[81]總結了在牛奶和肉制品（包括雞肉、鴨肉、魚和豬肉）中藥物分析的表面增強拉曼光譜方法和應用。

3.4.2食品摻假檢測

在經濟效益的推動下，不法生產者在食品里面摻假以謀取不法利益。拉曼光譜用于食品摻假的研究已經廣泛存在，Joshi等[82]使用1295 cm-1作為特征峰進行拉曼成像，對假雞蛋的內外參數進行無侵入分析，并且結合算法可以實現真假雞蛋的區分。Oroian 等[83]基于拉曼光譜研究了摻入果糖、葡萄糖、轉化糖、水解菊粉糖漿和麥芽汁的蜂蜜，結合 PLS-DA算法對于正宗蜂蜜和摻假蜂蜜識別的總準確率可以達到96.54%。Xu等[84]對拉曼光譜用于食品摻假方面的研究進行了總結。

3.4.3食品品質檢測

拉曼光譜可以用于檢測食品品質， Ahmad等[85]利用拉曼光譜研究了溫度對德西酥油分子組成的影響，結果發現，隨著油溫升高，560～770 cm-1、790～1160 cm-1和1180～1285 cm-1的拉曼峰發生變化。在500～1800 cm-1的拉曼光譜范圍內，對于不同的烹飪溫度，用 PCA 算法進行了分類分析。發現140～180℃是德西酥油的烹飪的安全溫度，在此溫度內不會造成分子組成改變和營養流失。在魚肉的新鮮度方面，Velio?lu 等[86]用拉曼光譜結合化學計量分析實現對6種不同魚類的份魚類樣本的物種判別分析，并實現對新鮮、一次凍融和兩次凍融程度的魚肉進行區分。除了直接檢測肉質成分從而判斷食品是否變質外，還可以通過拉曼光譜檢測到肉類的剪切力，從而進行肉類質量評估。Fowler 等[87]用拉曼光譜預測了新鮮羊半膜嫩度，與粒度分析（Particle Size Analysis ，PSA ）測量相比，拉曼光譜可能是剪切力變化的更好指標。

3.4.4小結

由于樣品制備簡單，拉曼光譜能夠在食品藥物殘留、摻假和品質鑒定領域提供快速的檢測方法。其檢測的快速性為大范圍的食品快速檢測提供了可能，從而保障食品安全。

4存在的問題與展望

本文總結了典型拉曼光譜技術的原理和優缺

點，分析了拉曼光譜在植物檢測、土壤檢測、食品檢測和水質檢測領域的應用。作為分子光譜，拉曼光譜由于其快速測量、在體測量的特性在農業多領域檢測中已經取得了豐碩的研究成果。但是由于拉曼光譜在農業領域仍然是一個較新的技術，因此還有許多在農業領域應用的特異性問題需要解決，如光譜成像速度、光譜熒光干擾和靈敏度等。

4.1需解決的問題

光譜成像在農業領域是研究待測對象的物質成分空間分布的有力工具，但是當前的拉曼光譜成像速度還不能達到實時成像分析的目的。為了能夠研究包括植物、動物等研究對象在內的生理化學反應過程等，需要研究快速的拉曼光譜成像技術應用。受激拉曼光譜和相干反斯托克斯拉曼光譜技術能夠滿足這一要求，在未來的發展中，農業檢測對象的快速成像的研究中將會有更多關于這兩種技術的應用。

農業領域檢測對象大多是帶有強熒光的物質。熒光信號限制了拉曼信號的分析，許多樣品，尤其是生物樣品，在可見光的激發下產生很強的熒光信號，甚至湮沒拉曼信號。解決熒光信號干擾的問題也是拉曼光譜應用于農業檢測面臨的重要問題。降低拉曼光譜測量的熒光信號主要分兩個方面：一個是測量系統改進，另一個是算法處理。在測量系統改進方面，近紅外激發光激發樣品能夠有效減小樣品產生的熒光，1064 nm作為激發光，使用銦鎵砷探測器的拉曼系統，可以有效降低待測物質的熒光效應對拉曼測量的影響[88]。除了改變激發光波長，移頻激發拉曼差分光譜也能夠有效消除測量過程中的熒光。Theurer等[89]使用785 nm附近的兩個光源激發樣品，通過差分處理，對土壤進行表征，有效降低了熒光信號。在算法方面，主要有 airPLS 等算法[90]和多項式擬合算法進行基線校正。拉曼光譜在農業領域應用的研究中，研發適用于農業對象（土壤、水質、植物、動物等）的專用拉曼設備，從而獲得最佳的拉曼信號是發展方向。

拉曼光譜在農業領域需要更高的靈敏度進行目標物的識別、分析。超低濃度檢測物的定量問題吸引了研究者的關注。SERS 是超靈敏檢測的一個很有潛力的工具，但是在超低濃度檢測中，很強的信號起伏限制它成為一種定量技術。通過改進 SERS增強基底，可以針對不同的檢測物進行修飾，并且可以提高穩定性和靈敏度，增加重復利用次數，提高經濟性，而且現在有非金屬的SERS 基底能夠有很好的生物相容性[91]，為SERS 用于農業領域的研究拓寬思路。傅里葉拉曼光譜因為沒有色散元件，同樣能夠比色散型拉曼光譜儀信號更強[88]。共振拉曼光譜也是提升靈敏度的一種有效方法。未來的農業應用中，針對不同的研究環境和研究需求進行適合的技術選擇甚至將不同技術的優勢進行融合能夠提供更高的靈敏度。

4.2未來研究展望

在植物科學領域，在體檢測或監測的基體中多含有大量的水分，拉曼光譜作為對水不敏感的分子光譜廣泛應用于生命體的在體測量和檢測中。正是由于這一優勢，拉曼光譜越來越多的用于植物表型的研究中，尤其是對于植物表型在體傳感器的開發領域。無需過多的樣品制備，即可用拉曼光譜進行檢測和分析，這為大田植物的現場植物表型和狀態測量提供了快速分析和監測的方法和手段。同時，由于拉曼光譜的“分子指紋”特性，能夠表征植物體內的不同物質的成分和含量信息，因此在未來將會有更多的研究專注于使用拉曼光譜進行植物表型的研究等工作。

在動物科學領域，結合拉曼光譜和化學計量學方法能夠在體監測動物的生理化學狀況，從而推斷動物的健康狀況。但是對于活體動物中的監測的理化指標較少，現有典型的監測指標為葡萄糖[92]，需要有更多的研究來用于活體動物理化指標的監測。

農業領域檢測場景復雜多樣，因此需要不同測量方式的拉曼光譜儀以滿足實驗室和現場的測量需求。便攜式拉曼光譜儀可在現場用于植物的原位和在線測量，更加穩定和準確的便攜拉曼光譜測量方法需要進一步研究。遙測拉曼光譜儀的測量已經有關于水溫測量的研究[73，74]，但至今還沒有用于農業其他方面的研究，需要進一步研究和分析。未來甚至可以將主動光源激發的拉曼光譜儀裝在無人機和農機設備上，從而實現地面和近地面的聯動信息獲取。

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Typical Raman Spectroscopy Ttechnology and Research Progress in Agriculture Detection

GAO Zhen1，2 ， ZHAO Chunjiang1，2 ， YANG Guiyan2 ， DONG Daming2*

（1. College of Information and Electrical Engineering， China Agricultural University， Beijing 100083， China;2. National Engineering Research Centerfor Information Technology in griculture， Beijing Academy of Agricul‐ture and Forestry Sciences， Beijing 100097， China ）

Abstract： Raman spectroscopy is a type of scattering spectroscopy with features such as rapid， less susceptible to moisture inter‐ ference， no sample pre-treatment and in vivo detection. As a powerful characterization tool for analyzing and testing the molecu‐ lar composition and structure of substances， Raman spectroscopy is also playing an extremely important role in the detection of plant and animal phenotypes， food safety， soil and water quality in the agricultural field with the continuous improvement of Ra‐ man spectroscopy technology. In this paper， the detection principles of Raman spectroscopy are introduced， and the new pro‐ gresses of eight Raman spectroscopy technology are summarized， including confocal microscopy Raman spectroscopy， Fourier transform Raman spectroscopy， surface-enhanced Raman spectroscopy， tip-enhanced Raman spectroscopy， resonance Raman spectroscopy， spatially shifted Raman spectroscopy， frequency-shifted excitation Raman difference spectroscopy and Raman spectroscopy based on nonlinear optics， etc. And their advantages and disadvantages and application scenarios are prerented， re‐ spectively. The applications of Raman spectroscopy in plant detection， soil detection， water quality detection， food detection， etc. are summarized. It can be specifically subdivided into plant phenotype， plant stress， soil pesticide residue detection， soil col‐ ony detection， soil nutrient detection， food pesticide detection， food quality detection， food adulteration detection， and water quality detection. In future agricultural applications， the elimination of fluorescence background due to complex living organ‐ isms in Raman spectroscopy is the next research direction. The study of stable enhanced substrates is an important direction in the application of Surface Enhanced Raman Spectroscopy （SERS）. In order to meet the measurement of different scenarios， por‐ table and telemetric Raman spectrometers will also play an important role in the future. Raman spectroscopy needs to be further explored for a wide variety of research objects in agriculture， especially for applications in animal science， for which there is still a paucity of relevant studies up to now. In the existing field of agricultural research， it is necessary to pursue the character‐ ization of more specific substances by Raman spectroscopy， which can prompt the application of Raman spectroscopy for a wid‐ er range of uses in agriculture. Further， the pursuit of lower detection limits and higher stability for practical applications is also the direction of development of Raman spectroscopy in the field of agriculture. Finally， the challenges that need to be solved and the future development directions of Raman spectroscopy are proposed in the field of agriculture in order to bring more in‐ spiration to future agricultural production and research.

Key words： Raman spectroscopy; plant phenotyping; plant stress detection; soil detection; pesticide residue detection; water quality detection; food detection