小檗堿對佐劑誘導型類風濕性關節(jié)炎大鼠OPG-RANKL 的作用研究

韓 丹，臧金鵬

（1.三亞市中醫(yī)院中藥房，海南 三亞 572000；2.三亞市中醫(yī)院特色診療部，海南 三亞 572000）

類風濕關節(jié)炎（RA）是一種自身免疫性疾病，表現(xiàn)為滑膜增生異常、細胞侵襲以及軟骨和骨骼的逐步破壞，會導致關節(jié)破壞、僵硬、畸形和致殘。非甾體類抗炎藥、糖皮質激素和緩解疾病的抗風濕藥等傳統(tǒng)療法可以減輕類風濕關節(jié)炎癥狀，但長期使用這些藥物會導致許多不良反應，如肝腎功能不全、胃腸反應等[1-2]。

骨保護素（OPG）/核因子κB 配體（RANKL）和核因子-κB（NF-κB）信號通路與類風濕關節(jié)炎的病理發(fā)展密切相關[3]。OPG/RANKL 信號調節(jié)系統(tǒng)在骨骼代謝和破骨細胞形成中起著至關重要的作用[4]。NF-κB 是調節(jié)炎癥和免疫反應的重要轉錄因子，對類風濕關節(jié)炎至關重要，研究發(fā)現(xiàn)通過抑制NF-κB 信號傳導途徑，可以改善類風濕關節(jié)炎患者和實驗動物的炎癥反應、滑膜細胞增殖和關節(jié)損傷[5]。小檗堿是一種異喹啉類生物堿，是多種草藥的主要生物活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗微生物、抗糖尿病、抗腫瘤和神經(jīng)保護作用[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)小檗堿可通過抑制TNF-α、IL-6和MCP-1 的產(chǎn)生，下調環(huán)氧合酶2（COX-2）的表達，減少PGE2 的生成抑制炎癥，另外通過核因子-kB（NF-κB）和有絲分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信號級聯(lián)反應抑制MMP-2 和MMP-9 的表達[8-9]。本研究探究了小檗堿對實驗性類風濕關節(jié)炎大鼠的作用，并探究了相關機制。

1 材料與方法

1.1 試劑 小檗堿（B832574，純度 ≥97%）購自上海麥克林生化科技有限公司（中國）；白介素（IL，Interleukin）-1β、IL-6 和腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）-α 大鼠ELISA 試劑盒購自達科為生物技術有限公司（中國）；p-IκBα 和p-p65 購自Santa 生物公司（美國）；RANKL、OPG 和GAPDH 一抗均購自CST 生物公司（美國）。

1.2 動物 Sprague Dawley 大鼠，SPF 級，25 只，雄性，購自海南醫(yī)學院實驗動物中心，飼養(yǎng)于12 h 光照/12 h黑暗更替的SPF 級動物房，適應1 周，自由飲食和飲水，所用動物試驗均經(jīng)過我院倫理委員會的批準和同意。

1.3 佐劑誘導型關節(jié)炎（adjuvant-induced arthritis，AIA）大鼠模型 根據(jù)之前文獻描述建立AIA 大鼠模型[10]，向SD 大鼠的左后爪足墊注射100 μL 含有10 mg/mL 結核分枝桿菌完全弗氏佐劑（complete Freund’s adjuvant，CFA）。對照組大鼠注射100 μL 生理鹽水，然后將大鼠隨機分為5 組（每組n=5）：對照組（生理鹽水的正常大鼠），模型組（生理鹽水的AIA 大鼠），低劑量組（20 mg/kg小檗堿的AIA大鼠），中劑量組（40 mg/kg 小檗堿的AIA 大鼠），高劑量組（60 mg/kg 小檗堿的AIA 大鼠）。從首次造模開始，灌胃給予小檗堿或生理鹽水，每天1 次，連續(xù)28 d。

1.4 足腫脹、關節(jié)炎評分 從首次造模開始，每4 d利用排水法測量左后爪體積，即足腫脹，直至第28 d。根據(jù)之前文獻報道[10]，從第12 d 開始，每4 d 進行一次關節(jié)炎評分，評分標準如下：0 表示無紅斑或腫脹跡象；1 表示腳趾紅斑或腫脹；2 表示爪子腫脹發(fā)紅；3 表示嚴重的紅腫和踝關節(jié)腫脹；4 表示所有腳指和整個腿部嚴重腫脹，無能力承受體重，每只大鼠的總分是4 只爪子評分的綜合，最大值16。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）第28 天，從眼眶后靜脈穿刺收集血液樣品，并在4 ℃以5 000 r/min 離心20 min 分離血清。根據(jù)制造商操作說明采用商用ELISA 試劑盒測定血清IL-6、TNF-α 和IL-1β 的含量。將50 μL 樣品稀釋液和50 μL 待測血清添加到ELISA包被的板中，然后將100 μL 酶試劑添加到上述混合溶液中，并在37 ℃下孵育60 min。洗滌板后，將50 μL 顯影劑A 和50 μL 顯影劑B 混合加入板中，將板在37℃黑暗中孵育15 min，用酶標儀在450 nm 下測量吸光度。根據(jù)標準曲線，計算IL-6、TNF-α 和IL-1β 的濃度。

1.6 組織病理檢測 大鼠處死后，收集后爪關節(jié)并立即固定于多聚甲醛（4%）溶液24 h，然后置于10%乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣，每周更換1 次，連續(xù)4 周，脫鈣后，乙醇梯度脫水，二甲苯洗滌，并包埋于石蠟中。最后，切成5 μm 薄片，用蘇木精-伊紅染色，并用光學顯微鏡觀察拍照。關節(jié)組織評分標準[11]：0 表示關節(jié)周圍無炎性細胞浸潤；1 表示炎性細胞浸潤最小；2表示輕微浸潤；3 表示中度浸潤；4 表示重度浸潤。

1.7 蛋白印跡（Western blot，WB）分離大鼠的滑膜組織，加入蛋白裂解液，并在4 ℃下以15 000 g 離心15 min 分離上清液，然后通過BCA 對其進行定量。通過應用6%～10% SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，然后轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，用脫脂奶粉室溫封閉90 min。隨后，p-IκBα、p-p65、RANKL、OPG和GAPDH一抗（按1:1 000稀釋）于4 ℃孵育過夜。然后，與HRP 標記的二抗于室溫孵育90 min，用ECL試劑盒檢測蛋白條帶，并使用圖像分析軟件image lab 5.1 分析。

1.8 統(tǒng)計學分析 使用GraphPad Prism 7.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，采用單向方差分析（ANOVA）進行多組間統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1 小檗堿對AIA 大鼠足腫脹和關節(jié)炎評分的影響 足腫脹結果表明，與對照組比較，模型組大鼠的足體積從第4 d 開始明顯增加，第12 d 有所緩解，但依然大于對照組，持續(xù)至試驗結束；較模型組，給予小檗堿治療后，AIA 大鼠的足腫脹明顯緩解，并且具有劑量依賴性，數(shù)據(jù)詳見圖1A。關節(jié)炎評分結果表明，與對照組比較，從第12 d 開始，模型組大鼠的關節(jié)炎評分明顯升高，第20 d 達到最大，持續(xù)至試驗結束；較模型組，給予小檗堿治療后，AIA 大鼠的關節(jié)炎評分明顯下降，并具有劑量依賴性，數(shù)據(jù)詳見圖1B。

圖1 小檗堿對AIA 大鼠足腫脹和關節(jié)炎評分的影響

2.2 小檗堿對AIA 大鼠血清中炎癥因子的影響 如圖2 顯示，與對照組比較，模型組大鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 的含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義；但較模型組，小檗堿治療后，AIA 大鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的含量顯著降低，呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義，詳見圖2。

圖2 小檗堿對AIA 大鼠血清中炎癥因子的影響

2.3 小檗堿對AIA 大鼠踝關節(jié)病理損傷的影響 如圖3 顯示，對照組大鼠踝關節(jié)病理顯微照片，關節(jié)腔清晰可見，無異常；模型組大鼠出現(xiàn)大量的炎性細胞浸潤、滑膜組織增生、關節(jié)腔狹窄和血管痙攣；給予小檗堿治療后，AIA 大鼠的病理明顯改善，尤其是高劑量組可明顯改善炎性細胞浸潤和滑膜增生。

圖3 小檗堿對AIA 大鼠踝關節(jié)病理損傷的影響

2.4 小檗堿對AIA 大鼠OPG/RANKL/NF-κB 信號的影響 如圖4 所示，與對照組比較，模型組大鼠組織中p-IκBα、p-p65 和RANKL 的蛋白表達顯著升高，但OPG 表達下降；較模型組，小檗堿治療后，AIA 大鼠組織中p-IκBα、p-p65 和RANKL 的蛋白表達顯著降低，OPG 表達升高，呈劑量依賴性，詳見圖4。

圖4 小檗堿對AIA 大鼠OPG/RANKL/NF-κB 信號的影響

3 討論

小檗堿是一種異喹啉生物堿，廣泛存在于多種植物中，包括黃連、黃蘆木、黃柏等，具有抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化等多種生物學活性。AIA 大鼠模型廣泛應用于評估抗風濕藥和類風濕關節(jié)炎的研究，是最常見的動物模型之一，其臨床和組織學特征與人類類風濕關節(jié)炎相似。因此，本研究首先建立了AIA 大鼠模型，發(fā)現(xiàn)與對照組比較，模型組大鼠表現(xiàn)為關節(jié)腫脹和關節(jié)炎評分明顯升高，血清炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α 升高，這些說明本研究成功建立了AIA 大鼠模型。

臨床上，類風濕關節(jié)炎患者主要表現(xiàn)為關節(jié)腫脹及運動障礙，AIA 大鼠表現(xiàn)關節(jié)腫脹，但給予小檗堿治療后，AIA大鼠的關節(jié)腫脹和關節(jié)炎評分明顯緩解。X 線和關節(jié)炎指數(shù)是判斷類風濕關節(jié)炎患者嚴重程度的重要參考[11]，本研究也發(fā)現(xiàn)AIA 大鼠的關節(jié)炎評分增加，類風濕關節(jié)炎患者表現(xiàn)為滑膜組織炎性細胞浸潤、滑膜細胞增殖等，本研究也發(fā)現(xiàn)AIA 大鼠表現(xiàn)了炎性細胞浸潤、滑膜組織增生、關節(jié)腔狹窄和血管痙攣等類風濕關節(jié)炎特征，小檗堿治療后，AIA 大鼠的上述變化均出現(xiàn)緩解。

機體免疫紊亂與類風濕關節(jié)炎的病理發(fā)展密切相關，促炎性細胞因子由免疫細胞產(chǎn)生，可以引起持續(xù)的慢性炎癥并驅動類風濕關節(jié)炎的發(fā)展[12-13]。TNF-α由單核細胞、T 細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，通過激活白細胞、滑膜成纖維細胞、破骨細胞、內皮細胞并抑制調節(jié)性T 細胞的功能，導致炎癥和骨侵蝕，TNF-α 在炎癥反應中具有重要作用[14]。IL-6 也是由多種免疫細胞產(chǎn)生的，可以激活白細胞、破骨細胞和內皮細胞，促進滑膜成纖維細胞的增殖，并且在某些方面類似于TNF-α。IL-1β 有助于T 細胞的分化，也可以激活軟骨細胞和破骨細胞，其活化和產(chǎn)生主要與NLRP3 炎性小體介導的信號有關[15]。本研究發(fā)現(xiàn)AIA 大鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 明顯升高，說明機體出現(xiàn)了免疫紊亂和炎癥反應，但給予小檗堿治療后，炎癥因子含量明顯下降。另外，有研究發(fā)現(xiàn)小檗堿對Treg/Th17 平衡的改善作用，這表明小檗堿可以調節(jié)AIA 大鼠脾臟T 細胞的分化[16]。這些說明了小檗堿對AIA 大鼠的關節(jié)炎癥狀改善與調節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)和炎癥反應有關。

NF-κB 轉錄因子在調節(jié)炎癥和免疫反應中具有重要作用。據(jù)報道，動物模型和類風濕關節(jié)炎患者的滑膜組織出現(xiàn)了NF-κB 激活和產(chǎn)生[17]。在正常生理條件下，NF-κB 與NF-κB 抑制劑蛋白IκB 結合形成無活性復合物，位于細胞質中。病理條件下，IκB 激酶的抑制劑（IKKa/IKKβ）通過RANKL 與RANK 結合而被激活，隨后IκB 被磷酸化，然后降解并與NF-κB 分離。然后，NF-κB 轉錄因子被激活并轉移到細胞核，其靶基因被激活以表達許多炎癥介質和細胞因子，如IL-10，IL-1β，TNF-α，IL-6，IFN-γ 和IL-17 等[18]。另外，NF-κB 激活也是一種炎癥介質正反饋的結果，這種反饋機制引起了類風濕關節(jié)炎炎癥的維持和進展以及結構破壞[19]。本研究發(fā)現(xiàn)AIA 大鼠的NF-κB 信號激活，但小檗堿抑制了AIA 大鼠NF-κB 信號。此外，NF-κB轉錄因子在破骨細胞生成和RANKL 誘導的骨吸收中起關鍵作用[20]，這表明小檗堿對骨組織代謝也具有調節(jié)作用。

OPG/RANKL/RANK 是骨組織代謝的重要信號調節(jié)系統(tǒng)，并在骨吸收和破骨細胞的分化和成熟中起關鍵作用[21]。RANKL 是受體RANK 或OPG 的配體，主要表達于成骨細胞/基質細胞表面。在成熟的破骨細胞或前體破骨細胞中，RANKL 與RANK 結合可促進破骨細胞的生成和骨吸收[22]。OPG 由成骨細胞/基質細胞產(chǎn)生，通過與RANKL 結合并隨后抑制RANKRANKL 相互作用，強烈阻止破骨細胞的分化和骨吸收。因此，認為OPG/RANKL 是類風濕關節(jié)炎治療的標志物。臨床發(fā)現(xiàn)類風濕關節(jié)炎患者OPG/RANKL 比率低與骨骼吸收增強有關[23]。本研究發(fā)現(xiàn)小檗堿降低了AIA 大鼠RANKL 的表達，增加OPG 的產(chǎn)生，并增加OPG/RANKL 的比例，這說明小檗堿的抗類風濕關節(jié)炎活性與OPG/RANKL/RANK 介導的骨穩(wěn)態(tài)有關。

綜上所述，本研究首先建立了AIA 大鼠模型，為后續(xù)小檗堿的干預研究提供了基礎。進一步發(fā)現(xiàn)，小檗堿可以緩解AIA 大鼠的關節(jié)炎癥狀，并且與NF-κB介導的免疫穩(wěn)態(tài)和OPG/RANKL/RANK 介導的骨穩(wěn)態(tài)有關。但小檗堿對NF-κB 和OPG/RANKL/RANK 信號的調節(jié)是否是直接作用，仍需進一步探究。