海參體腔液提取物對南美白對蝦自溶的抑制作用

聶 斌 李傲婷 崔小凡 杜椅楠 閻佳楠 吳海濤,2

(1. 大連工業大學食品學院，遼寧 大連 116034；2. 國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧 大連 116034)

南美白對蝦(Penaeusvannamei)是全球最重要的水產養殖三大蝦種之一，占全球年產量的近80%[1]，是中國對蝦養殖的主要經濟種類。2020年，中國南美白對蝦產量高達120萬t，具有極大的經濟價值。但是，由于蝦類自身酶系豐富，捕撈后內源酶導致蛋白質降解，嚴重影響蝦類的品質，導致蝦類肉質變軟甚至自溶[2-3]。據報道，天冬氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶是引起蝦肉蛋白質降解的主要因素[4-5]，來自蝦頭的蛋白酶對蝦的肌肉組織有顯著的降解作用，并與蝦的質地有關[6-8]。為了減緩由蝦類自溶引起的質量損失，通常在蝦糜制品中加入蛋白酶抑制劑[9]等來抑制其蛋白質的降解。

許多動物體液都具有蛋白酶抑制劑的作用。在牛、豬和雞的血漿中發現的抑制劑具有蛋白酶抑制活性，可作為抑制原料自溶的基料使用[10-12]，但因瘋牛病及宗教和習俗等原因，畜牧蛋白酶抑制劑的應用受到限制。因此，開發利用水生動物蛋白酶抑制劑越來越重要。研究表明，蛋白酶抑制劑廣泛存在于水生動物體液中，如斑馬魚和泥鰍[13]、鯉魚[14]。海參(Stichopusjaponicus)是一種重要的水生生物，具有豐富的營養和滋補價值[15]，其體腔液是海參加工中的主要副產品，占海參總重量的5%～10%。因此，以海參體腔液作為原料，開發食源性天然蛋白酶抑制劑，具有一定的研究價值。

研究擬探究南美白對蝦自溶過程中蛋白質降解的適宜條件。并在該基礎上，以十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、三氯乙酸(TCA)可溶性寡肽釋放量為指標研究海參體腔液及其提取物對蝦肉自溶中蛋白質降解的抑制作用，以期為海參體腔液的綜合開發和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮海參(Stichopusjaponicus)和南美白對蝦(Penaeusvannamei)：大連當地市場；

所用其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 主要儀器設備

垂直電泳儀：AE-6450型，日本ATTO公司；

微量臺式離心機：Micro 17R型，美國Thermo Scientific公司；

往復式脫色搖床：TS.B-108型，其林貝爾儀器制造有限公司；

凝膠成像儀：MF-ChemiBIS 2.0型，以色列DNR Bio-imaging公司；

真空冷凍干燥機：2KBTES-55型，美國Virtis公司；

酶標定量測定儀：Infinite200 NANO型，瑞士TECAN公司；

精密pH計：PHS-3型，上海雷磁儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 原料預處理 新鮮南美白對蝦去頭，去皮，放入勻漿機中充分攪碎，所得蝦糜備用。

1.2.2 海參體腔液提取物的制備 根據文獻[16]略作修改，取鮮活海參，切頭去尾，收集其體腔液，立刻在4 ℃，3 000×g條件下進行離心15 min。取適量離心后的上清液于-80 ℃保存，作為海參體腔液樣品備用。其余上清液進一步經磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)于4 ℃下透析(3.5 kDa)處理20 h，透析后樣品經凍干，回收凍干粉，作為海參體腔液提取物樣本備用。

1.2.3 南美白對蝦蝦糜自溶的適宜條件

(1) pH的影響：取0.1 g南美白對蝦蝦糜樣品與0.1 mL 磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液進行混合，用磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液調節pH至3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0。在50 ℃孵育2 h后，獲得南美白對蝦蝦糜樣品。

(2) 溫度的影響：根據1.2.3(1)的方法，在pH 3.0的條件下，將孵育溫度分別設置為30，40，50，60，70 ℃，孵育2 h，獲得南美白對蝦蝦糜樣品。

(3) 時間的影響：根據1.2.3(1)和1.2.3(2)的方法，在pH 3.0和溫度50 ℃的條件下，將孵育時間分別設置為1，2，3，4，5，6 h，獲得南美白對蝦蝦糜樣品。

1.2.4 海參體腔液及其提取物對蝦肉糜自溶的影響 根據文獻[17]31所述，將南美白對蝦蝦糜與一定濃度的海參體腔液及其提取物進行復配，于磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖體系下，在pH 3.0和50 ℃條件下處理樣品。針對海參體腔液，添加海參體腔液含量為80%，自溶組條件為水50 ℃孵育2 h，以冰上孵育2 h樣品作為對照組。針對海參體腔液提取物，蝦靡和體腔液提取物混合樣品與緩沖液體系的料液比為1∶5 (g/mL)，海參體腔液提取物添加量分別為3.13，6.25，12.50，25.00 g/100 g蝦糜。

1.2.5 SDS-PAGE電泳分析 根據文獻[18]所述，待南美白對蝦蝦糜孵育結束后，按m南美白對蝦蝦糜∶V上樣緩沖液=1∶3 (g/mL) 加入5×上樣緩沖液使其反應終止。將樣液混合震蕩12 h后，取10 μL樣品進行上樣，采用5%分離膠和10%濃縮膠，在15 mA電流下進行電泳。利用考馬斯亮藍R-250對凝膠進行染色，通過凝膠成像儀拍照成像。

1.2.6 TCA可溶性寡肽含量測定 根據文獻[19]略作修改，南美白對蝦蝦糜孵育結束后，以m南美白對蝦蝦糜∶VTCA=1∶2 (g/mL)比例添加預冷的20 g/100 mL TCA使其反應終止，待測樣液在室溫條件下靜置20 min后離心15 min，所得上清液采用Folin-酚法進行肽含量的測定。以新鮮蝦靡樣液為對照，設置數值為1，計算TCA可溶性寡肽相對含量。

1.3 數據處理

所有試驗進行3次重復。結果以均數±標準差(SD)表示。采用Student’st軟件進行統計分析，P<0.05的水平表示具有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 pH對南美白對蝦蝦糜自溶過程中蛋白質降解的影響

SDS-PAGE電泳可以按分子量分離蛋白質組分，如圖1所示，南美白對蝦蛋白質組成較為清晰，在200 kDa左右處可觀察到肌球蛋白重鏈，在44.3 kDa左右處觀察到肌動蛋白條帶。與對照組新鮮蝦糜相比，當pH值為3.0時，肌球蛋白重鏈和肌動蛋白條帶灰度最低，隨著pH逐漸升高至8.0時，肌球蛋白重鏈和肌動蛋白條帶灰度逐漸回升，結果表明，當pH為3.0時，對南美白對蝦蝦糜蛋白的降解程度最顯著。因此，確定了南美白對蝦蝦糜自溶過程中蛋白質降解的適宜pH條件為3.0。

HM. 標準分子量Marker (高) LM. 標準分子量Marker(低) R. 新鮮南美白對蝦蝦糜圖1 pH對南美白對蝦蝦糜自溶中蛋白質降解的影響Figure 1 The effects of pH on protein degradation in autolysis of white shrimp (Penaeus vannamei)

2.2 溫度對南美白對蝦自溶過程中蛋白質降解的影響

隨著孵育溫度變化，蛋白質的降解程度也有所不同。如圖2所示，當孵育溫度由30 ℃逐漸升高時，蛋白質的降解程度逐漸增強，溫度達到50 ℃時，蛋白質的降解程度最為顯著，表現為肌球蛋白重鏈和肌動蛋白條帶灰度最低，表明南美白對蝦蝦糜蛋白質降解的適宜溫度為50 ℃。當溫度超過50 ℃后，隨著溫度的升高，肌球蛋白重鏈和肌動蛋白條帶灰度逐漸增強，表明蛋白質降解程度逐漸降低。胡玲萍等[20]在探究南極磷蝦自溶前后氨基酸和胰蛋白酶降解產物的變化時發現，南極磷蝦自溶酶最適溫度為55 ℃，與試驗結論相類似。Sriket等[21]、Buarque等[22]也得到了較為相似的結果。

HM. 標準分子量Marker (高) LM. 標準分子量Marker(低) R. 新鮮南美白對蝦蝦糜圖2 溫度對南美白對蝦自溶中蛋白質降解的影響Figure 2 The effects of temperature on protein degradation in autolysis of white shrimp (Penaeus vannamei)

2.3 時間對南美白對蝦自溶過程中蛋白質降解的影響

如圖3所示，在溫度為50 ℃、pH值為3.0的條件下，孵育時間越長，南美白對蝦蝦糜蛋白質的降解程度則越強，當孵育時間超過2 h后，肌球蛋白重鏈降解程度很強，表現為200 kDa左右處的蛋白條帶灰度較低。而44.3 kDa 左右處的肌動蛋白條帶隨著孵育時間的延長，降解程度與對照組相比有所提高，1～4 h內變化不大。

HM. 標準分子量Marker (高) LM. 標準分子量Marker(低) R. 新鮮南美白對蝦蝦糜圖3 孵育時間對南美白對蝦自溶中蛋白質降解的影響Figure 3 The effects of incubation time on protein degradation in autolysis of white shrimp (Penaeus vannamei)

綜上可知，南美白對蝦蝦糜自溶中蛋白質降解的適宜條件為pH值為3、孵育溫度50 ℃、孵育時間2 h。

2.4 海參體腔液對南美白對蝦自溶中蛋白質降解的影響

前期研究[17]19發現，新鮮海參體腔液中粗蛋白質量濃度約為(296.98±1.41) μg/mL，總糖質量濃度約為(71.45±1.23) μg/mL。經透析、凍干處理后得到的海參體腔液提取物中粗蛋白質量分數可達(9.05±0.17) g/100 g。在南美白對蝦蝦糜中添加新鮮海參體腔液，使體腔液終質量分數達到80 g/100 g，在上述確定的適宜條件下誘導蝦糜自溶，進一步通過TCA可溶性寡肽含量的變化，探究海參體腔液對南美白對蝦自溶過程中蛋白質降解的影響。

如圖4所示，經自溶誘導，蝦糜中TCA可溶性寡肽顯著釋放，與未添加海參體腔液的自溶樣品相比，海參體腔液可以顯著抑制TCA可溶性寡肽的釋放，說明海參體腔液具有抑制南美白對蝦蝦糜自溶的作用。

不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)圖4 海參體腔液對南美白對蝦自溶過程中蛋白質降解的影響Figure 4 The effects of coelomic fluid of sea cucumber on protein degradation during autolysis of white shrimp (Penaeus vannamei)

2.5 海參體腔液提取物對南美白對蝦自溶中蛋白質降解的影響

在此基礎上，進一步將新鮮海參體腔液進行透析、凍干，從而得到海參體腔液提取物，并利用SDS-PAGE分析海參體腔液提取物對南美白對蝦自溶中蛋白質降解的影響。

海參體腔液提取物對南美白對蝦自溶中蛋白質降解的影響如圖5所示，海參體腔液提取物主要抑制蝦糜肌動蛋白的降解，表現為44.3 kDa左右處的肌動蛋白條帶與自溶組相比灰度較高，且隨著海參體腔液提取物添加量增加至6.25 g/100 g蝦糜以上，抑制能力有所提高，且添加6.25～25.00 g/100 g蝦糜提取物的南美白對蝦蝦靡自溶作用差別不大。

HM. 標準分子量Marker (高) R. 新鮮南美白對蝦蝦靡 C. 未添加提取物的南美白對蝦自溶樣品 1～4. 添加3.13，6.25，12.50，25.00 g/100 g蝦糜海參體腔提取物的樣品 S. 25.00 g/100 g的海參體腔液的提取物 LM. 標準分子量Marker(低)圖5 海參體腔液提取物對南美白對蝦自溶過程中蛋白質降解的影響Figure 5 The effects of coelomic fluid isolaton extracts of sea cucumbers on protein degradation during autolysis of white shrimp (Penaeus vannamei)

2.6 海參體腔液提取物對南美白對蝦自溶過程中TCA可溶性寡肽釋放的影響

當海參體腔液提取物添加量為12.50 g/100 g蝦糜時，TCA可溶性寡肽釋放量被顯著抑制(P<0.05)，當海參體腔液提取物添加量為25.00 g/100 g蝦糜時，抑制率可達39.0%(見圖6)。綜上，海參體腔液提取物能有效抑制南美白對蝦蝦糜自溶中蛋白質的降解程度。

不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)R. 新鮮南美白對蝦樣液 C. 未添加提取物的南美白對蝦自溶樣品圖6 海參體腔液提取物對南美白對蝦自溶過程中TCA可溶性寡肽釋放的影響Figure 6 The effects of coelomic fluid isolaton extracts of sea cucumbers on TCA-soluble oligopeptide release during autolysis of white shrimp (Penaeus vannamei)

3 結論

南美白對蝦是中國對蝦養殖的主要經濟種類，為了降低由蝦類自溶引起的質量損失，試驗在蝦糜制品中加入海參體腔液提取物來抑制其蛋白質的降解。南美白對蝦蝦糜自溶中蛋白質發生顯著降解的條件為孵育溫度50 ℃、pH值3.0、孵育時間2 h。海參體腔液及其提取物能有效地抑制南美白對蝦蝦糜蛋白質的降解。