硫酸化修飾對紅棗多糖結構及抗氧化活性的影響

鞏曉佩 張 建 郭筱兵 毛曉英 張連富,2

(1. 石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000；2. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122)

紅棗(ZiziphusjujubaMill.)又稱大棗、棗子、刺棗，為鼠李科棗屬植物[1]，具有多糖、維生素、黃酮、環核苷酸、多酚、生物堿等活性物質[2-3]。這些生物活性物質具有抗氧化、抗腫瘤、保護肝臟、抗菌等生物活性[4]。中國作為世界上棗主產國，干棗產量占世界產量的98%[5]。新疆南疆地區由于早晚溫差大及光照時間長等優勢成為中國紅棗生產最佳地區。因南疆地區紅棗加工產業單一，紅棗產量逐年升高的同時也產生了大量殘次紅棗，造成紅棗資源的大量浪費，殘次紅棗資源的再利用成為人們日益關注的問題。對紅棗生物活性物質進行深入研究，可進一步開發利用南疆殘次棗資源。

研究擬以殘次紅棗為研究對象，純化紅棗多糖(ZJP-1)后進行硫酸化修飾后得到紅棗多糖硫酸化衍生物S-ZJP-1，通過光譜技術對其組成和結構進行鑒定，并通過體外活性試驗探究紅棗多糖的體外抗氧化活性，以期為進一步開發利用南疆殘次紅棗資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

殘次紅棗：新疆石河子農貿市場；

正丁醇、吡啶、三氯甲烷、氯磺酸、剛果紅、DPPH、硫酸亞鐵、甲酰胺、苯酚：分析純，天津市富宇精細化工有限公司；

單糖標準品(阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、果糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸共8種)：色譜純，上海源葉生物科技有限公司；

抗壞血酸、EDTA-2Na：分析純，上海啟仁化工有限公司。

1.1.2 儀器設備

真空冷凍干燥機：HX-10-50B型，上海圣科儀器設備有限公司；

多功能酶標儀：ENK-PRO型，美國Bioteck公司；

400兆超導核磁共振波譜儀：AVANCE Ⅲ HD型，德國Bruker公司；

傅里葉變換紅外光譜儀：Nicolet IS 10型，美國Thermo公司；

紫外可見分光光度計：TU-1901型，北京普析通用儀器公司；

掃描電子顯微鏡：S-3400N型，日本Hitachi公司。

1.2 方法

1.2.1 紅棗多糖的提取純化

(1) 多糖提?。簠⒖糦ang等[12]的方法稍作修改。將干燥的紅棗粉末用體積分數為95%的乙醇在70 ℃下回流，持續4 h，收集殘余物冷凍干燥。將干燥后殘余物用沸水萃取，合并上清液，60 ℃減壓濃縮至原來的1/4～1/5，脫蛋白(Sevag法)，脫色(AB-8大孔樹脂)，加無水乙醇(V無水乙醇∶V濾液=4∶1)置于冰箱冷藏靜置過夜，4 000 r/min 離心15 min，收集沉淀物，經冷凍干燥24 h后得到紅棗粗多糖(ZJP)。

(2) 分離純化：參考楊燕敏等[13]的方法略作修改。將ZJP在蒸餾水中溶解，離心除沉淀，放入DEAE-52離子交換柱中，用蒸餾水和0.2 mol/L NaCl溶液先后進行洗脫。使用自動部分收集器進行收集，用硫酸苯酚法顯色，并在490 nm檢測吸光度。將紅棗多糖溶液通過Sephadex-200葡聚糖凝膠柱進行進一步分離和純化。冷凍干燥，以獲得純的紅棗多糖(ZJP-1)。

1.2.2 硫酸化紅棗多糖衍生物的制備 參考Zhang等[14]的方法，分別稱取50 mg的ZJP-1、S-ZLP-1，用甲酰胺進行溶解，超聲30 min后加入酯化試劑，反應結束后冰水浴冷卻，用4 mol/L的NaOH中和至pH為7。4 ℃下透析3 d。透析結束后加3倍體積的無水乙醇，4 ℃靜置12 h，收集沉淀，冷凍干燥24 h后得到硫酸化紅棗多糖(S-ZJP-1)。

1.2.3 多糖理化性質的測定

(1) 硫酸基含量：采用BaCl2—明膠法[15]，標準曲線方程為y=0.398 8x+0.045 8，R2=0.997 6。

(2) 總糖含量：采用苯酚—硫酸法[16]，標準曲線方程為y=0.461 5x+0.060 3，R2=0.999 4。

(3) 蛋白質含量：采用考馬斯亮藍法[17]，標準曲線方程為y=1.069 4x+0.035 9，R2=0.999 1。

(4) 單糖組成：采用離子色譜法[18]。精密稱量10.00 mg 樣品置于安瓿瓶中，加入3 mol/L 三氟乙酸(TFA)10 mL，120 ℃水解3 h。準確吸取5 mL酸水解溶液轉移至試管中氮吹吹干，加入5 mL水渦旋混勻。吸取100 μL溶液，加入900 μL去離子水，經12 000 r/min離心5 min取上清液分析。色譜柱：DionexCarbopac TMPA20 (3 mm×150 mm)；流動相：A為H2O；B為250 mmol/L NaOH；C為50 mmol/L NaOH + 500 mmol/L NaOAc；流速0.3 mL/min；進樣量5 μL；柱溫30 ℃；檢測器為電化學檢測器。

1.2.4 紅外光譜分析 稱取ZJP-1、S-ZLP-1各1 mg，取20 mg溴化鉀(KBr)混合并研磨均勻后進行壓片，掃描波長范圍為4 000～400 cm-1。

1.2.5 高碘酸氧化分析 參考Xue等[19]的方法略作修改，分別稱取25 mg ZJP-1、S-ZLP-1與15 mL的50 nmol/L NaIO4溶液混合，測定223 nm處的吸光度值，至終吸光度值不變為止，蒸餾水作為對照組，根據標準曲線y=0.075 1x+0.087 5，R2=0.997 3，按式(1)計算高碘酸的消耗量。取2 mL混合溶液，用0.01 mol/L NaOH溶液滴定，以酚酞為指示劑，根據式(2)計算甲酸生成量。

A=(50-A1)×15，

(1)

A0=(0.01×Ai)×Aj，

(2)

式中：

A——高碘酸消耗量，mmol；

A1——反應后高碘酸濃度，mol/L；

A0——甲酸生成量，mmol；

Ai——NaOH溶液滴定體積，mL；

Aj——反應體積，mL。

1.2.6 剛果紅試驗 參考徐雅琴等[20]的方法測定ZJP-1、S-ZLP-1多糖組分是否有三螺旋結構。稱少量的ZJP-1、S-ZLP-1組分配制成質量濃度為2 mg/mL的溶液，取1 mL濃度為0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mol/L NaOH溶液分別與1 mL的待測樣品混合，然后加入2 mL的80 μmol/mL 剛果紅溶液，室溫放置10 min，于200～600 nm 范圍內掃描最大吸收波長并記錄。

1.2.7 掃描電鏡分析 ZJP-1、S-ZLP-1的表面形態用SEM觀察，放大倍數為100倍和400倍。

1.2.8 多糖的抗氧化性分析

(1) DPPH自由基清除能力：參考Li等[21]的方法稍作修改，準備0.1 mmol/L DPPH溶液并在黑暗中貯存。分別準備0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL ZJP-1和S-ZJP-1溶液。取2 mL多糖溶液與2 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液，混合靜置30 min，測量510 nm處吸光度。以VC為陽性對照，根據式(3)計算ZJP-1和S-ZJP-1的DPPH自由基清除率。

(3)

式中：

A——DPPH自由基清除率，%；

A0——不加多糖的吸光度；

A1——加入多糖后的吸光度；

A2——不加DPPH溶液的吸光度。

(2) 還原力：參考Ji等[22]的方法，準備0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)，1%鐵氰化鉀溶液，10%的三氯乙酸溶液和0.1%的三氯化鐵溶液，分別準備0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL ZJP-1和S-ZJP-1溶液，50 ℃水浴30 min 后加入2 mL 10%三氯乙酸溶液，以5 000 r/min離心20 min，加入2.5 mL蒸餾水和1.5 mL 0.1%氯化鐵溶液，靜置10 min后測量700 nm處吸光度值。以EDTA-2Na為陽性對照，按式(4)計算ZJP-1和S-ZJP-1的還原能力。

(4)

式中：

A——還原力；

A0——不加樣品的吸光度；

A1——加入樣品后的吸光度；

A2——不加FeCl3溶液的吸光度。

1.3 數據處理

所有試驗重復3次，用SPSS軟件進行數據統計處理，采用Origin 8.5軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 純化紅棗多糖及硫酸化紅棗多糖的理化指標

由表1和表2可知，硫酸化修飾后的紅棗多糖取代度為0.45，與ZJP-1相比，S-ZJP-1的總糖和蛋白質含量均下降，其中多糖含量降低可能是硫酸化修飾過程中酸性條件引起了多糖的降解。兩種紅棗多糖均由3種單糖構成，分別是葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖，不同單糖所占摩爾分數不同。說明不同的硫酸化修飾并未改變紅棗多糖的單糖組成，硫酸化會導致硫酸化衍生物的單糖組成的微小變化，不會改變硫酸化多糖主鏈。伯繼芳等[23]也發現硫酸化結構修飾不會破壞杏鮑菇多糖主鏈。

表1 ZJP-1和S-ZJP-1的單糖物質的量組成Table 1 The quantitative composition of the monosaccharides of ZJP-1 and S-ZJP-1%

表2 ZJP-1和S-ZJP-1的理化指標?Table 2 Physical and chemical indexes of ZJP-1 and S-ZJP-1

2.2 紅棗多糖及其硫酸化多糖的結構表征

圖1 ZJP-1和S-ZJP-1的紅外光譜Figure 1 IR spectrum of ZJP-1 and S-ZJP-1

2.2.2 高碘酸氧化分析 高碘酸氧化是一種選擇性的氧化反應，一般作用于多糖分子中二羥基和三羥基連接處?？赏ㄟ^高碘酸消耗量和甲酸生成量判斷出糖苷鍵的位置[27]。由圖2中NaIO4的標準曲線計算結果得，ZJP-1消耗2.31 mmol的高碘酸并生成0.92 mmol的甲酸，S-ZJP-1消耗2.14 mmol的高碘酸并生成0.81 mmol的甲酸。高碘酸的消耗量大于甲酸生成量的2倍，推測存在只消耗高碘酸而不產生甲酸的類型，即存在(1→2)和(1→4)連接的糖苷鍵。既消耗高碘酸又生成甲酸說明ZJP-1和S-ZJP-1均存在(1→6)連接的糖苷鍵。其中也可能存在不消耗高碘酸且不生成甲酸的類型，存在少量(1→3)連接的糖苷鍵。綜上，通過高碘酸氧化的反應原理初步推斷多糖ZJP-1和S-ZJP-1中均存在(1→2)(1→4)(1→6)和少量(1→3)連接的糖苷鍵。

圖2 ZJP-1和S-ZJP-1的高碘酸鈉標準曲線Figure 2 NaIO4 standard curve of ZJP-1 and S-ZJP-1

2.2.3 剛果紅試驗 在堿性溶液中，含有三股螺旋結構的多糖會與剛果紅形成復合物，其最大吸收波長會產生紅移；由此判斷多糖是否具有三股螺旋結構[24]。由圖3可以看出，NaOH溶液濃度從0.0～0.5 mol/L，兩種紅棗多糖ZJP-1和S-ZJP-1與剛果紅反應，其最大吸收波長均隨NaOH溶液濃度的增加而逐漸減小，可以判斷這兩種紅棗多糖不具備三螺旋結構。這與Barbara等[28]研究結果一致，一般多種單糖組成的多糖不易形成三股螺旋結構。

圖3 ZJP-1和S-ZJP-1的剛果紅試驗結果Figure 3 Experimental results of Congo red of ZJP-1 and S-ZJP-1

2.2.4 掃描電鏡 從圖4可以看出，ZJP-1和S-ZJP-1多糖微觀結構有明顯差異。ZJP-1多為不規則的大塊片狀結構，而S-ZJP-1為不規則小塊片狀結構，說明硫酸化處理改變了紅棗多糖的結構。Qian等[29]也指出不同種類、提取純化方法和結構改性方法處理后多糖的微觀結構有差異。

圖4 ZJP-1和S-ZJP-1的掃描電鏡圖像Figure 4 Scanning electron microscope images of ZJP-1 and S-ZJP-1

2.3 多糖抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力 由圖5可知，兩種紅棗多糖均顯示較強的DPPH自由基清除活性，且兩種紅棗多糖的DPPH自由基清除活性隨紅棗多糖質量濃度的增加而升高。當質量濃度<0.2 mg/mL時，ZJP-1的DPPH自由基清除活性高于S-ZJP-1。但當質量濃度>0.2 mg/mL時，S-ZJP-1較ZJP-1顯示出更強的DPPH自由基清除活性，當質量濃度達到0.5 mg/mL時，其DPPH自由基清除活性為47.6%，而ZJP-1為40.4%，說明經硫酸化修飾改變多糖的理化性質和空間構象使多糖DPPH自由基清除能力明顯增強，同時，較高質量濃度的硫酸化修飾的紅棗多糖相比純化紅棗多糖有更高的DPPH自由基清除能力，與宋見喜等[30]結果一致。

圖5 ZJP-1和S-ZJP-1的DPPH自由基清除作用Figure 5 DPPH clearance of ZJP-1 and S-ZJP-1

2.3.2 總還原力 由圖6可知，ZJP-1和S-ZJP-1均有一定程度的還原力，并隨著質量濃度的增加，兩種紅棗多糖的還原力上升，為濃度依賴型。其中S-ZJP-1較ZJP-1顯示出更強的還原力，當S-ZJP-1質量濃度達到0.5 mg/mL時，其還原力最強，為0.531，而此時ZJP-1的還原力為0.419。經過硫酸化修飾的紅棗多糖相比純化紅棗多糖還原力增高，可能與兩種紅棗多糖的分子量與糖苷鍵有關。申進文等[31]研究也發現多糖提取物具有較強的體外抗氧化性能，其還原力隨多糖濃度的增大逐漸增強。

圖6 ZJP-1和S-ZJP-1的還原力作用Figure 6 The reducing power effect of ZJP-1 and S-ZJP-1

綜上，S-ZJP-1對DPPH自由基的清除能力以及還原能力均優于ZJP-1。這是因為多糖引入硫酸基后，改變了多糖的空間構象，從而引起了生物活性的改變。

3 結論

結果表明，純化紅棗多糖和硫酸化紅棗多糖均為吡喃型多糖，由半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖3種單糖組成，不含三螺旋結構，均為無規則片狀形態。純化紅棗多糖和硫酸化紅棗多糖均具有較好的抗氧化性，且硫酸化紅棗多糖的抗氧化性強于純化紅棗多糖。綜上所述，硫酸化修飾并未破壞紅棗多糖的主鏈結構，只取代多糖殘基上的某一些羥基，從而改變多糖的分子結構，提高其生物活性，在抗氧化方面具有很好的應用前景，尤其在功能性食品、醫藥領域以及化妝品行業的廣泛應用。關于硫酸化多糖體外活性與其取代度、分子量等的構效關系以及作用機制有待進一步研究。