紅茶菌菌相分析及優勢菌的分離與鑒定

徐素云 李佳佳 方 偉 王艷萍 耿偉濤

(天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457)

紅茶菌是一種歷史悠久的民間傳統發酵茶飲料，是以糖、茶、水為原料，經醋酸菌、酵母菌和乳酸菌等多種微生物共同自然發酵而成，口感宜人，富含茶多酚、有機酸等多種活性功能成分，營養豐富[1]。目前紅茶菌發酵多使用天然混菌體系家庭式發酵，其菌相組成復雜，菌種差異較大，導致發酵后的紅茶菌品質不穩定[2]，發酵菌種的確定是關鍵因素。在菌相學分析方面，紅茶菌中可能出現的優勢菌主要包括三大類：醋酸菌、酵母菌及乳酸菌[3]。其中又以醋酸菌和酵母菌更為常見，且不同產地來源的紅茶菌其菌相組成有所不同，代謝產物也不一樣，因此想要實現工業化生產，還需進一步對菌種進行基礎研究。

研究擬以河南濟源地區民間流傳的紅茶菌為原料，采用傳統分離培養技術，對紅茶菌發酵液中可培養微生物進行分離鑒定，同時，采用高通量測序技術對紅茶菌菌相進行測序和菌相組成分析，一方面可系統了解紅茶菌中微生物多樣性及菌相結構，另一方面可為豐富微生物菌種資源庫及實現紅茶菌的工業化生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原輔材料與試劑

綠茶：杭州明杭茶葉有限公司；

蔗糖：河南金潤食品添加劑有限公司；

DNA Marker Taq酶、dNTP、引物、瓊脂糖、細菌基因組DNA提取試劑盒、酵母基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2 菌種及培養基

紅茶菌母液菌種：河南中沃實業有限公司；

MRS培養基、Elliker培養基、YPD培養基：天津市江天化工技術有限公司；

溴甲酚紫顯色培養基：天津市博迪化工有限公司。

1.2 儀器與設備

恒溫培養箱：HT-400B型，上海赫田科學儀器有限公司；

臺式高速冷凍離心機：Sorvall ST 8R型， 美國Thermo fisher Scientific公司；

凝膠成像采集分析系統：Gel Doc XR+型，美國伯樂BIO-RAD公司；

擴增儀：ETC 811 PCR型，上海珂準儀器有限公司；

顯微鏡：YS100型，日本 Nikon 公司；

超凈工作臺烘箱：HF safe 900型，杭州旭眾機械設備有限公司；

酶標儀：Multiskan GO型，美國Thermo公司；

電泳儀：DYY-6D型，北京市六一儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 紅茶菌發酵液制備 將10 g綠茶放入剛煮沸的開水中浸泡10 min，用紗布過濾后加入80 g蔗糖，用蒸餾水定容至1 000 mL，分裝于食品級玻璃瓶中，90 ℃水浴10 min。冷卻后按體積分數8%接種量將紅茶菌母液接種于茶湯中，常溫發酵12 d，得到pH值為2.3～2.9的紅茶菌發酵液。

1.3.2 采用16S rDNA和ITS高通量分析紅茶菌中微生物組成 選擇紅茶菌發酵液作為樣品進行微生物菌相探究，試驗分為細菌16S rDNA和真菌ITS測序，由廣州基迪奧生物科技有限公司完成。

(1) DNA 提取及擴增：采用基因組提取試劑盒提取總DNA。以20～30 ng DNA為模板，細菌選擇V4～V5 區通用擴增引物 341F 和806 R 的16S rDNA 基因進行擴增[4]；真菌選擇引物 ITS1F和ITS2的ITS 區進行PCR擴增試驗[5-7]，引物設計見表1。

(2) 生物信息學分析：

① 序列處理與優化：通過 Illumina Miseq 高通量測序平臺整理原始數據，采用QIIME軟件檢查及剔除嵌合體序列[8]。

② Alpha多樣性分析：根據最低的測序深度，隨機重復提取OTU豐度矩陣中的所有樣本，并使用QIIME軟件計算每個樣本的生物多樣性，主要包括Shanno、Simpson、Chao1、Ace指數等[9]。

③ 分類信息分析：通過RDP classifier軟件對各樣品中OTU依次進行門、綱、目、科、屬水平的分類統計。

1.3.3 紅茶菌中醋酸菌、乳酸菌、酵母菌的篩選與鑒定

(1) 菌株初篩：參照王潔琛等[10-11]的方法略作修改。將紅茶菌發酵液依次稀釋為10-5，10-6，10-7濃度的樣品，涂布至不同分離培養基上，觀察菌落特征及菌株個體形態，初步區分菌種的差異和類別。在溴甲酚紫顯色培養基上挑選有明顯菌落形態、革蘭氏染色陰性和過氧化氫酶試驗陽性的菌株，初步視為醋酸菌；在MRS及Elliker培養基上挑選有明顯菌落形態、革蘭氏染色陽性和過氧化氫酶試驗陰性菌株，初視為乳酸菌；在YPD培養基上挑選具有明顯菌落形態特征，鏡檢個體較大的菌株，初步視為酵母菌。

(2) 分子生物學鑒定：參照陳寵等[12]的方法，并將PCR擴增產物送至廣州基迪奧生物有限責任公司進行測序，其測序結果上傳NCBI數據庫進行BLAST在線比對分析。

1.3.4 數據統計分析 采用 SPSS 16.0 和 Origin 8.5 軟件分析和處理數據。

2 結果與討論

2.1 紅茶菌中細菌和真菌群落多樣性及其組成

2.1.1 細菌及真菌Alpha多樣性 由表2可知，紅茶菌中細菌及真菌的Coverage值均達到99.9%以上，表明樣本測序結果可以反映樣品的真實情況，即此次取樣是合理的。此外，紅茶菌中細菌的Shannon、Simpson、ACE、Chao1指數和OTU數量均極顯著大于真菌(P<0.01)，表明細菌群落豐富度與多樣性大于真菌，與徐偉等[4]的結果一致。

表2 Alpha多樣性?Table 2 Alpha diversity

2.1.2 細菌的微生物組成 由圖1(a)可知，在門水平下，從紅茶菌發酵液中共鑒定出5個細菌門，其中變形菌門(Proteobacteria)相對含量占絕對優勢，相對豐度高達99.20%，其次為厚壁菌門(Firmicutes)，相對豐度為0.54%，其他菌門總體豐度為0.07%左右。因此，在門水平下，可以確定變形菌門為優勢菌。由圖1(b)可知，在綱水平下，共鑒定出5個細菌綱，其中豐度最高的是α-變形菌(Alphaproteobacteria)，相對豐度為99.20%左右，其次為芽孢桿菌綱(Bacilli)，相對豐度為0.50%，其他菌綱總體豐度在0.07%左右，表明α-變形菌綱為優勢菌。由圖1(c)可知，在目水平下，共鑒定出5個細菌目，豐度最高的是醋酸菌目(Acetobacteralesc)，相對豐度為99.20%，其次是乳桿菌目(Lactobacillales)，含量占0.48%，還有少量的擬桿菌目(Bacteroidales)、梭桿菌目(Fusobacterium)和棲熱菌目(Thermales)(共占0.07%左右)，表明目水平下醋酸菌目及乳桿菌目為優勢菌。由圖1(d)可知，在科水平下，共鑒定出6個細菌科，豐度最高的是醋酸菌科(Acetobacteraceae)占92.20%，其次是乳桿菌科(Lactobacillaceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)，分別占0.45%，0.03%，還有少量的擬桿菌科(Bacteroidaceae)、梭桿菌科(Fusobacteriaceae)、棲熱菌科(Thermaceae)(共占0.05%左右)，表明科水平下醋酸菌科和乳桿菌科為優勢菌。由圖1(e)可知，在屬水平下，共鑒定出7個細菌屬，豐度最高的是駒形氏桿菌(Komagataeibacter)占97.85%，其次是醋酸桿菌屬(Acetobacter)、乳桿菌屬(Lactobacillus)分別占1.23%，0.43%，還有少量的明串株菌屬(Leuconostoc)、擬桿菌屬(Bacteroides)、鯨桿菌屬(Cetobacterium)、亞棲熱菌屬(Meiothermus)(總體豐度為0.08%左右)，表明駒形氏桿菌屬、醋酸桿菌屬和乳酸桿菌屬為優勢菌，與Xia等[2]結果相似。駒形氏桿菌多為專性好氧菌，可產生細菌纖維素，且產酸能力強，在工業上常用于生產醋酸[13]。醋酸桿菌對有機酸及揮發性風味物質的形成至關重要。乳酸桿菌屬是紅茶菌發酵液中常見的優勢菌屬，能使紅茶菌口感更柔和飽滿，促進揮發物質酯類、酸類、醇類等物質的產生[14]。因此，將紅茶菌細菌群落在門、綱、目、科、屬水平下的組成關系繪制成圖(見圖2)。

圖1 各水平下細菌群落的相對百分含量Figure 1 Relative percentage of bacterial community at each level

由圖2可知，紅茶菌發酵液的細菌菌落組成中，主要為駒形氏菌屬(97.85%)、醋酸菌屬(1.23%)和乳酸菌屬(0.43%)，其中駒形氏菌屬和醋酸菌屬均屬于變形菌門，并且是變形菌門的兩大主要菌屬；乳桿菌屬屬于厚壁菌門，在厚壁菌門中所占相對比例達79.6%。

圖2 細菌群落組成關系Figure 2 Microbial community composition of bacteria

2.1.3 真菌的微生物組成 由圖3可知，在門水平下，子囊菌門(Ascomycota)的豐度最高，占92.87%，為門水平下的優勢菌。子囊菌門是真菌中最大的一個門，相對于其他真菌而言，子囊菌門結構復雜，因此稱為高等真菌；在綱水平下，酵母綱(Saccharomycetes)的豐度最高，占92.04%，其次為糞殼菌綱(Sordariomycetes)，占0.001%，表明酵母綱為優勢菌；在目水平下，酵母目(Saccharomycetales)的豐度最高，占92.04%，其次為糞殼菌(Sordariales)占0.001%，可認為酵母目為目水平下的優勢菌。糞殼菌目多含有各種腐敗菌，可能是傳統自然發酵紅茶菌中不良的雜菌，可對風味產生不良影響，與王春龍[15]結果相似；在科水平下，豐度最高的是酵母科(Saccharomycetaceae)，占71.5%，其他未鑒定菌科總體豐度為20.55%左右；在屬水平上，豐度最高的是德克酵母屬(Dekkera)占42.1%，其次是接合酵母屬(Zygosacchaormyces)占29.42%，其他未識別的屬占20.74%，可認為德克酵母屬、接合酵母屬為優勢菌。釀酒酵母和接合酵母是傳統發酵制品中最常用的菌種，也是產生酒精及各種揮發性風味物質的主要菌種，在發酵過程中，兩種酵母均能夠產生酯類、高級醇類和酸類等揮發性化合物[16]。因此，將紅茶菌真菌群落在門、綱、目、科、屬水平下的組成關系繪制成圖(見圖4)。

圖3 各水平下真菌群落的相對百分含量Figure 3 The relative percentage of microorganisms at the various level

由圖4可知，傳統紅茶菌發酵液的真菌菌落構成中，德克酵母屬和接合酵母屬為主要優勢菌屬，且均屬于酵母菌綱。

圖4 真菌群落組成關系Figure 4 Microbial community composition of fungus

2.2 紅茶菌中優勢菌的分離與鑒定

2.2.1 醋酸菌的篩選與鑒定 通過溴甲酚紫平板篩選試驗、過氧化氫酶試驗、革蘭氏染色試驗及菌落個體形態觀察，初步篩選出7株具有典型形態的菌株，其菌落特征和鏡檢形態觀察如圖5所示，特征描述見表3。

從左至右依次編號為1478，1480，1506，1508，1510，1512，1514圖5 各菌株的菌落及菌體形態Figure 5 Bacterial colonies and individual morphology of each strain

表3 醋酸菌的菌落形態和鏡檢形態的特征描述Table 3 The described of colony morphology and microscopic morphology of acetic acid bacteria

由圖6可知，擴增產物電泳帶均明亮單一，其片段長度均為1 500 bp左右。將7株菌株的測序結果上傳NCBI數據庫進行BLAST 在線比對發現，菌株1478與食糖駒形氏桿菌(Komagataeibactersaccharivorans)比對相似度為98%，菌株1480與腐爛蘋果醋酸桿菌(Acetobactermalorum)比對相似度為99%，菌株1506/1508/1512/1514與木駒形氏菌(Komagataeibacterxylinus)比對相似度均為100%，菌株1510與醋酸桿菌屬(Acetobacter)比對相似度為100%。結合醋酸菌落形態、個體形態分析，參考細菌鑒定手冊，可以鑒定菌株1478為食糖駒形氏桿菌、1480為腐爛蘋果醋酸桿菌、1506/1508/1512/1514為木駒形氏菌醋酸菌、1510為醋酸桿菌屬。7株菌大致分為4個種2個屬，與高通量研究結果吻合，表明試驗分離出的菌株為優勢菌株，其中1506/1508/1512/1514木駒形氏菌的產酸能力、產膜能力較強，1478食糖駒形氏桿菌的代謝糖能力強且能產生很多風味物質，1510醋酸桿菌經常被用來釀造食醋[17-18]。

M為DNA Marker；1～8依次為菌株1478、1480、1506、1508、1510、1512和1514的擴增產物圖6 PCR產物電泳圖Figure 6 Electrophoresis of PCR products

2.2.2 酵母菌的篩選與鑒定 通過對紅茶菌發酵液中真菌的分離篩選，挑選出3株疑似酵母菌株，其菌落特征和鏡檢形態觀察如圖7所示，特征描述見表4。

從左至右依次編號為1482，1484，1486圖7 各菌株的菌落及菌體形態Figure 7 Bacterial colonies and individual morphology of each strain

表4 酵母菌落形態和鏡檢形態的特征描述Table 4 Cellular and colonial morphology of yeast

由圖8可知，擴增產物電泳帶均明亮單一，其片段長度均為600 bp左右。將3株菌株的測序結果上傳NCBI數據庫進行BLAST 在線比對發現， 菌株1482、1484與拜耳接合酵母(Zygosaccharomycesbailii)比對相似度均為100%，菌株1486與布魯塞爾德克酒香酵母(Dekkerabruxellensis)比對相似度為98%。結合酵母菌落形態、個體形態分析，參考真菌鑒定手冊，可以鑒定篩選的目的酵母菌1482及1484為拜耳接合酵母、1486為布魯塞爾德克酒香酵母。分離出的3株菌大致分為接合酵母屬和德克酵母屬2個屬，與高通量研究結果相吻合，再一次證明了分離出的菌株為優勢菌株，其中菌株1482及1484為拜耳接合酵母，被應用于各種發酵制品如酒類、醋類，其代謝能力強，菌株風味好[19]；菌株1486釀酒酵母因代謝乙醇能力強，常被用作釀酒菌種[20]。

M為DNA Marker；1～3依次為菌株1482、1484和1486的擴增產物圖8 PCR產物電泳圖Figure 8 Electrophoresis of PCR products

2.2.3 乳酸菌的篩選與鑒定 從MRS及Elliker培養基中篩選能使溴甲酚紫—乳粉培養基變黃，革蘭氏陽性，過氧化氫接觸酶陰性的菌株，初步篩選出一株菌落干燥，較小，圓形，邊緣整齊，低凸起，白色，鏡檢為短桿的菌株，其菌落特征和鏡檢形態觀察如圖9所示。

圖9 菌株1298的菌落、菌體形態圖Figure 9 Morphology of bacterial colonies and bacteria of strain 1298

由圖10可知，擴增產物電泳帶均明亮單一，其片段長度均為1 500 bp左右。將菌株的測序結果上傳NCBI數據庫進行BLAST 在線比對發現，菌株1298與植物乳桿菌(Lactobacillus.plantarum)的同源性為99%。結合乳酸菌落形態、個體形態分析，參考細菌鑒定手冊，可以鑒定篩選的目的乳酸菌1298為植物乳桿菌，與高通量研究結果相吻合，表明分離出的菌株為優勢菌株。植物乳桿菌是紅茶菌發酵液常見優勢菌株，具有產乳酸、丁酸等特性[21-22]。

M為DNA Marker；1為菌株1298擴增產物圖10 PCR產物電泳圖Figure 10 Electrophoresis of PCR products

3 結論

采用16S rDNA和ITS高通量分析了紅茶菌發酵液中微生物組成。高通量測序結果表明：細菌群落豐富度與多樣性大于真菌。細菌中駒形氏桿菌(Komagataeibacter)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)和乳桿菌屬(Lactobacillus)為優勢菌株；真菌中德克酵母屬(Dekkera)和接合酵母屬(Zygosacchaormyces)為優勢菌株。通過傳統平板分離法得到醋酸菌7株，分別為食糖駒形氏桿菌1478(Komagataeibactersaccharivorans1478)、腐爛蘋果醋酸桿菌1480(Acetobactermalorum1480)、木駒形氏菌1506/1508/1512/1514(Komagataeibacterxylinus1506/1508/1512/1514)、醋酸桿菌屬1510(Acetobacter1510)；酵母菌3株，分別為拜耳接合酵母1482/1484 (Zygosaccharomycesbailii1482/1484)和布魯塞爾德克酒香酵母1486(Dekkerabruxellensis1486)；乳酸菌1株，為植物乳桿菌1298(Lactobacillus.plantarum1298)。后續需對優勢菌株性能進行深入研究。