生熟酸棗仁及其皮、仁成分差異性與抗氧化活性研究

肖鳳琴 劉 暉 楊亦柳 于 倩 李 佳 張紅印 邵 帥 李光哲 嚴銘銘,2

(1. 長春中醫藥大學，吉林 長春 130117；2. 吉林省中藥保健食品科技創新中心，吉林 長春 130117)

酸棗仁為鼠李科植物酸棗干燥成熟的種子，是衛生部頒布的第一批藥食同源藥物，富含皂苷、生物堿、黃酮、酚酸、脂肪油以及多糖等多種成分，在改善睡眠、抗焦慮、改善記憶、抗氧化方面具有良好的藥理活性，臨床上常被用于治療失眠等中樞神經系統疾病[1-2]。

研究[3-4]表明，酸棗仁中的黃酮類、皂苷類、酚酸類以及脂肪酸類成分具有良好的抗氧化活性。而有關酸棗仁皮部位、仁部位的抗氧化活性研究尚未見報道。課題組前期研究發現，酸棗仁具有良好的抗氧化活性，且酸棗仁皮部位治療失眠的作用優于仁部位。

研究擬探討生熟酸棗仁的皮、仁、全棗仁對超氧陰離子自由基、羥基自由基、DPPH自由基、ABTS自由基的清除率及對鐵離子的還原能力，并對其成分進行分析，旨在為酸棗仁作為天然抗氧化劑開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

紫外—可見分光光度計：UV-1700型，日本島津公司；

數顯恒溫水浴鍋：HH-6型，金壇市佳美儀器有限公司；

電子天平：AB135-S型，瑞士Mettler Toledo公司；

電子天平：MS303S型，奧豪斯儀器有限公司；

超聲波清洗器：KQ-205B型，昆山市超聲儀器有限公司；

低速臺式離心機：DT5-2B型，北京時代北利離心機有限公司；

高效液相色譜儀：Agilent1260型，美國Agilent Technologies公司；

粉碎機：MFJ-W300型，北京利仁科技股份有限公司；

多功能酶標儀：Infinite M200pro型，瑞士Tecan公司。

1.2 材料與試劑

酸棗仁：河北仁心藥業有限公司；

DPPH：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；

Tris-HCl：分析純，廣州賽國生物科技有限公司；

鄰苯三酚：分析純，天津市光復精細化工研究所；

鄰二氮菲、K3Fe(CN)6：分析純，天津永晟精細化工有限公司；

FeCl3：分析純，西隴科學股份有限公司；

三氯乙酸：分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司；

蘆丁標準品、沒食子酸標準品：中國藥品生物制品檢定所；

人參皂苷Re標準品：上海源葉生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備 按2020版《中華人民共和國藥典》中的炮制方法對酸棗仁進行炒制[5]，制得熟酸棗仁。將生熟酸棗仁進行剝離，分別得到相應的皮和仁共6種樣品：生、熟酸棗仁(全棗仁)，生、熟酸棗仁(仁)，生、熟酸棗皮(皮)。

1.3.2 體外抗氧化活性研究

(1) 樣品制備：精密稱取生熟酸棗仁的皮部位、仁部位和全棗仁(過四號篩)各2 g，加入70%乙醇20 mL回流提取2 h，提取液轉移至50 mL試管中，濾渣用5 mL體積分數為70%乙醇洗滌，合并洗液與濾液，離心，取上清液，并用70%乙醇定容至25 mL。

(1)

式中：

C——自由基清除率，%；

A0——空白對照組吸光度值；

A1——樣品組吸光度值；

A2——樣品對照組吸光度值。

(3) 羥基自由基(·OH)清除率測定：參照張思頡等[7]的方法并修改。取鄰二氮菲溶液1 mL于各試管，加入2 mL PBS溶液，1 mL樣品液，混勻后加入1 mL FeSO4溶液，混勻，加入1 mL H2O2溶液，混勻。37 ℃水浴1 h，測定536 nm處吸光度值A1，用蒸餾水調0。以1 mL蒸餾水代替樣品液測得A2；以1 mL蒸餾水代替H2O2溶液測得A0。按式(2)計算·OH清除率。

(2)

式中：

C——羥基自由基(·OH)清除率，%；

A0——空白對照組吸光度值；

A1——樣品組吸光度值；

A2——樣品對照組吸光度值。

(4) DPPH自由基清除率測定：參照張雪嬌等[8]的方法并修改。于96孔板中加入樣品溶液100 μL，再加入DPPH溶液100 μL，渦旋混勻。暗室反應30 min，測定517 nm處吸光度值A1；以100 μL甲醇代替DPPH溶液作為樣品對照組，測定吸光度值A2。按式(1)計算DPPH自由基清除率。

(5) ABTS自由基清除率測定：參照張雪嬌等[8]的方法并修改，取0.4 mL ABTS工作液，用pH為7.4的PBS溶液稀釋，常溫下734 nm處吸光值為(0.7±0.2)。將0.2 mL ABTS工作液與10 μL不同濃度樣品混合，常溫避光反應6 min，測定734 nm處吸光度，平行3次。按式(3) 測定ABTS自由基清除率。

(3)

式中：

C——ABTS自由基清除率，%；

A1——樣品+ABTS溶液吸光度值；

A0——PBS溶液+ABTS溶液的吸光度。

(6) FRAP還原能力測定：取樣品液2.5 mL，分別加入PBS溶液2.5 mL，1% K3Fe(CN)6溶液2.5 mL，混勻，50 ℃水浴20 min，取出后迅速冷卻，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，混勻，3 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加蒸餾水2.5 mL，0.1% FeCl3溶液0.5 mL，搖勻，靜止10 min，測定700 nm處吸光度值A1，以2.5 mL蒸餾水代替樣品溶液作為樣品對照組，測得A2，以蒸餾水作空白調0，按式(4)計算還原能力大小[9]。

C=A1-A2，

(4)

式中：

C——還原能力；

A1——樣品組吸光度值；

A0——樣品對照組吸光度。

1.3.3 不同組織部位成分差異性分析

(1) 總黃酮含量測定：取生熟酸棗仁的全棗仁、皮和仁粉末(過四號篩)各2 g，參照2020版《中國藥典》中大豆黃卷總黃酮含量測定方法，以蘆丁為對照品，以相應試劑為空白。根據蘆丁標準曲線，計算樣品中總黃酮含量。

(2) 總皂苷含量測定：取生熟酸棗仁的全棗仁、皮和仁粉末(過四號篩)各2 g，參照2020版《中國藥典》中人參莖葉總皂苷含量測定方法，以人參皂苷Re為對照品，以相應試劑為空白。根據人參皂苷Re標準曲線，計算樣品中總皂苷含量。

(3) 總多糖含量測定：取生熟酸棗仁的全棗仁、皮和仁粉末(過四號篩)各2 g，參照2020版《中國藥典》中玉竹總多糖含量測定方法，以無水葡萄糖為對照品，以相應試劑為空白。根據無水葡萄糖標準曲線，計算樣品中總多糖含量。

(4) 總酚酸含量測定：取生熟酸棗仁的全棗仁、皮和仁粉末(過四號篩)各2 g，參照2020版《中國藥典》中大血藤總酚酸含量測定方法，以沒食子酸為對照品，以相應試劑為空白。根據沒食子酸標準曲線，計算樣品中總酚酸含量。

2 結果與分析

2.1 抗氧化活性

2.1.1 超氧陰離子清除率 超氧陰離子可誘導脂質、蛋白質及DNA的氧化損傷，在活性氧的形成中起重要作用，因此可通過測定抗氧化劑的超氧陰離子清除率來評價其抗氧化能力[10]。由圖1可知，生熟酸棗仁不同組織部位均對超氧陰離子具有一定的清除作用，其中生酸棗仁(全棗仁)的清除能力最強；熟酸棗仁(皮)和(仁)的清除能力強于生酸棗仁(皮)和(仁)部位，表明炮制后提高了酸棗仁(皮)和(仁)對超氧陰離子自由基的清除作用。

圖1 生熟酸棗仁不同組織部位的超氧陰離子自由基清除率Figure 1 Determination results of superoxide anion clearance in different tissue parts of raw and ripe ziziphi spinosae semen

2.1.2 羥基自由基清除率 羥基自由基能殺死紅細胞，降解DNA、細胞膜和多糖化合物，是毒性最大的氧自由基[11]。由圖2可知，生熟酸棗仁不同部位對羥自由基的清除率不同,其中，仁部位對羥基自由基的清除率最弱，皮的最高，其次為全棗仁，且熟制的各樣品的清除率高于生品。

圖2 生熟酸棗仁不同組織部位的羥基自由基清除率Figure 2 Determination results of hydroxyl radical scavenging rate in different tissue parts of raw and ripe ziziphi spinosae semen

2.1.3 DPPH自由基清除率 由圖3可知，生熟酸棗仁各組織部位對DPPH自由基均具有一定的清除能力，其中皮的清除力高于相應的全棗仁與仁。

圖3 生熟酸棗仁不同組織部位的DPPH自由基清除率Figure 3 Determination results of DPPH radical scavenging rate in different tissue parts of raw and ripe ziziphi spinosae semen

2.1.4 ABTS自由基清除率 由圖4可知，酸棗仁各樣品對ABTS自由基均具有較好的清除力；其中酸棗仁(皮)對ABTS自由基的清除作用高于全棗仁與仁，且熟酸棗仁的清除率整體高于生酸棗仁。

圖4 生熟酸棗仁不同組織部位的ABTS自由基清除率Figure 4 Determination results of ABTS radical scavenging rate in different tissue parts of raw and ripe ziziphi spinosae semen

2.1.5 FRAP還原能力 還原能力可以用來評價試驗樣品的抗氧化能力，吸光度值越大，抗氧化劑的抗氧化能力越強[12]。由圖5可知，各樣品均具有一定的還原能力，其中酸棗仁(皮)的還原能力高于全棗仁與仁，生熟酸棗仁(仁)的還原能力較對應的全棗仁與皮稍弱。

圖5 生熟酸棗仁不同組織部位的FRAP還原能力Figure 5 Determination results of FRAP reduction ability in different tissue parts of raw and ripe ziziphi spinosae semen

綜上，酸棗仁各部位對超氧陰離子自由基、羥基自由基、DPPH自由基及ABTS自由基的清除能力大小均為皮>全棗仁>仁；且酸棗仁(皮)的還原能力強于對應的全棗仁與仁。因此，酸棗仁各部位的抗氧化能力強弱為皮>全棗仁>仁，酸棗仁炮制前后的抗氧化活性并無明顯區別。

2.2 酸棗仁不同組織部位的成分含量

由表1可知，生酸棗仁(皮)中總黃酮含量最高，各樣品仁中總黃酮含量整體低于全棗仁與皮；各樣品皮中總皂苷、總酚酸含量高于全棗仁與仁；各樣品中總多糖含量相近，全棗仁與皮中的多糖含量高于仁；酸棗仁炮制前后各樣品中總皂苷、總黃酮、總酚酸以及總多糖含量未發生明顯變化。

表1 生熟酸棗仁不同組織部位的成分含量Table 1 Determination results of chemical components in different tissue parts ofraw and ripe ziziphi spinosae semen mg/g

3 結論

試驗表明，酸棗仁不同組織部位均具有良好的抗氧化活性，其中酸棗仁(皮)的抗氧化活性強于全棗仁與仁的，且酸棗仁(皮)中總黃酮、總皂苷、總酚酸含量均高于酸棗和仁，可初步推測酸棗仁(皮)中起抗氧化活性作用的藥效物質基礎為黃酮、皂苷和酚酸類成分；此外，酸棗仁炮制前后抗氧化活性無明顯差別。后續可采用不同研究方法對酸棗仁各組織部位進行體內抗氧化活性研究。