高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定油菜和油菜籽中草除靈殘留量

竇銀花

(上海必諾檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司，上海 201114)

草除靈是一種專(zhuān)效性芽后傳導(dǎo)性除草劑，用于油菜田防除豬殃殃和繁縷，對(duì)油菜安全，對(duì)闊葉雜草有效，具有內(nèi)吸傳導(dǎo)作用[1-2]。其可以經(jīng)由食物鏈、環(huán)境最終遷移至人和畜體內(nèi)。GB 2763—2016規(guī)定：草除靈于油菜籽內(nèi)的最大殘留限量(MRL)為0.2 mg/kg。從2004年開(kāi)始，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)禁止了除草靈的上市與應(yīng)用[3]。

食品中農(nóng)藥殘留分析是在復(fù)雜的基質(zhì)內(nèi)定性與定量分析目標(biāo)化合物。對(duì)于農(nóng)藥殘留而言，其分析步驟主要為提取、凈化、檢測(cè)，前2步為前處理，與分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性直接相關(guān)。目前中國(guó)還沒(méi)有關(guān)于草除靈的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，主要采用液相色譜法[3-5]和氣相色譜法[6-8]進(jìn)行檢測(cè)，而采用液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)測(cè)定草除靈的文獻(xiàn)較少[9-12]。研究擬采用乙腈提取，經(jīng)固相萃取柱凈化，LC-MS聯(lián)用技術(shù)測(cè)定油菜、油菜籽內(nèi)草除靈殘留量，旨在為草除靈的測(cè)定提供一種有成效的科學(xué)測(cè)試方法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試驗(yàn)設(shè)備

電子分析天平：BL60S型，德國(guó)賽多利斯公司；

渦旋振蕩器：945616型，美國(guó)Talboys公司；

搗碎機(jī)：FA25型，德國(guó)FLUKO公司；

高速冷凍離心機(jī)：Sovall ST16R型，美國(guó)賽默飛世爾公司；

氮吹儀：DC-24型，上海安譜實(shí)驗(yàn)室科技股份有限公司；

高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent infinityⅡ1290/QQQ 6470B型，美國(guó)安捷倫公司。

1.2 試劑與材料

油菜、油菜籽：市售；

乙腈、正己烷、甲苯：色譜純，美國(guó)Sigama公司；

氯化鈉：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

草除靈標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：(99.30±2.30)%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；

石墨化炭黑—氨基復(fù)合柱：500 mg/500 mg，容積6 mL，北京迪科馬科技有限公司；

氟羅里硅土(Florisil)固相萃取柱：500 mg/6 mL，美國(guó)Waters公司。

1.3 樣品前處理

(1) 油菜：精準(zhǔn)稱(chēng)量5.00 g已粉碎均勻的油菜，加入20 mL乙腈，15 000 r/min勻漿提取2 min，加入5～7 g氯化鈉，多次快速振蕩，8 000 r/min離心3 min，取上清移，加入10 mL乙腈，重復(fù)2次提取，準(zhǔn)確移取上清液10 mL，于40 ℃水浴中氮?dú)獯抵两桑尤? mL乙腈—甲苯溶液(V乙腈∶V甲苯為3∶1)，待凈化。

(2) 油菜籽：精準(zhǔn)稱(chēng)量5.00 g已粉碎均勻的油菜籽，加入10 mL乙腈—正己烷溶液的上層液體，渦旋振蕩，靜置30 min，準(zhǔn)確加入20 mL乙腈—正己烷溶液的下層液體，15 000 r/min 勻漿提取2 min，去除正己烷層，加入5～7 g 氯化鈉，劇烈振蕩，8 000 r/min離心3 min，取上清移，加入10 mL正己烷飽和的乙腈溶液，重復(fù)提取2次，準(zhǔn)確移取上清液10 mL，于40 ℃水浴中氮?dú)獯抵两桑尤? mL乙腈—甲苯溶液(V乙腈∶V甲苯為3∶1)，待凈化。

(3) 凈化：用5 mL乙腈—甲苯溶液預(yù)淋洗石墨化碳黑—氨基復(fù)合柱，棄去淋洗液。將待凈化液洗滌入固相萃取柱內(nèi)，通過(guò)3 mL的乙腈—甲苯(V乙腈∶V甲苯為3∶1)溶液洗滌，重復(fù)3次。于40 ℃水浴中氮吹至近干，加入1 mL 乙腈—水溶液(V乙腈∶V水為1∶1)復(fù)溶，過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)。

1.4 LC-MS分析條件

1.4.1 液相色譜 色譜柱為Poroshell 120 C18(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為2.0 mmol/L 乙酸銨—0.1%甲酸水溶液，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣體積5 μL，柱溫40 ℃，按表1進(jìn)行梯度洗脫。

表1 流動(dòng)相洗脫條件Table 1 The mobile phase elution conditions

1.4.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源，干燥氣溫度350 ℃，干燥氣流量5.1 L/min，霧化器壓力2.4×107Pa，鞘氣溫度300 ℃，鞘氣流速11.0 L/min，毛細(xì)管電壓4 000 V，噴嘴電壓1 100 V，正離子掃描模式，母離子和子離子質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 草除靈的母離子和子離子質(zhì)譜參數(shù)?Table 2 Themass spectrometry parameters of the precursor ion and product ion of benazolin

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精準(zhǔn)稱(chēng)量標(biāo)準(zhǔn)品草除靈，甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液。移取1 mL 標(biāo)準(zhǔn)貯備液，甲醇定容，配成質(zhì)量濃度分別為100.0，10.0，1.0，0.1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，用空白基質(zhì)分別配制0.025，0.050，0.100，0.500，1.000，2.000 μg/mL的草除靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，并繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.5.2 提取溶劑的選擇 選取乙腈(或正己烷飽和的乙腈)、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷4種不同極性的提取試劑，空白基質(zhì)中加入草除靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)其回收率。

1.5.3 固相萃取柱(SPE小柱)的選擇 選擇石墨化炭黑/氨基(GCB/NH2)復(fù)合SPE小柱和弗羅里硅土柱進(jìn)行對(duì)比，將草除靈標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到空白基質(zhì)中，轉(zhuǎn)移全部待凈化液至固相萃取柱凈化，經(jīng)儀器測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.5.4 復(fù)溶溶劑的選擇 取適量草除靈標(biāo)準(zhǔn)工作液于離心管中，氮?dú)獯蹈桑謩e加入乙腈、水、甲醇、乙腈+水(V乙腈∶V水為1∶1)、甲醇+水(V甲醇∶V水為1∶1)5種復(fù)溶標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

1.5.5 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià) 取適量草除靈標(biāo)準(zhǔn)農(nóng)藥貯備液，分別使用乙腈+水(V乙腈∶V水為1∶1)和空白基質(zhì)樣品處理液進(jìn)行定容，對(duì)相同質(zhì)量濃度的工作液進(jìn)行測(cè)定[13]。

1.5.6 空白基質(zhì)的加標(biāo)回收試驗(yàn) 油菜和油菜籽兩種空白基質(zhì)中分別添加0.03，0.06，0.15 mg/kg 3個(gè)水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率測(cè)定，各水平重復(fù)6次。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取試劑的選擇

根據(jù)草除靈標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的回收率可知，乙腈(或正己烷飽和的乙腈)、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷均能高效提取草除靈，其回收率均在80%以上。其中丙酮與基質(zhì)中的水互溶，難以進(jìn)一步用固相萃取柱凈化；乙酸乙酯和二氯甲烷在提取草除靈的同時(shí)，也提取出基質(zhì)中的脂肪、蛋白、色素等雜質(zhì)。對(duì)于基質(zhì)油菜籽，以正己烷飽和的乙腈作為提取溶劑時(shí)，乙腈能提取出溶于正己烷中的草除靈，正己烷又能去除乙腈中的脂類(lèi)雜質(zhì)，有利于進(jìn)一步凈化。

2.2 凈化小柱的選擇

由圖1～圖3可知，對(duì)于雜質(zhì)、色素，F(xiàn)lorisil柱的吸附能力較低，對(duì)草除靈目標(biāo)物的響應(yīng)干擾較大，且回收率為75%左右，而GCB/NH2柱帶有芳香性正六元環(huán)結(jié)構(gòu)，具有高凈化效果，能有效吸附色素和雜質(zhì)，近乎去除基質(zhì)中90%的雜質(zhì)，其獨(dú)特的選擇性能高效地將草除靈從雜質(zhì)中洗脫出來(lái)，回收率為85%左右。因此，選擇GCB/NH2柱作為凈化柱。

圖1 草除靈標(biāo)準(zhǔn)工作液譜圖Figure 1 Benazolin standard working solution spectrum

圖2 經(jīng)Florisil固相萃取柱凈化的草除靈標(biāo)準(zhǔn)譜圖Figure 2 Standard spectra of benazolin after purification by florisil solid-phase extraction column

圖3 經(jīng)GCB/NH2固相萃取柱凈化的草除靈標(biāo)準(zhǔn)圖譜Figure 3 Standard spectra of benazolin after purification by GCB/NH2 solid phase extraction column

2.3 復(fù)溶溶劑的選擇

由圖4可知，選擇單一的甲醇和乙腈作復(fù)溶溶劑回收率為70%左右，選擇水作為復(fù)溶溶劑回收率僅60%。而使用混合溶劑乙腈+水(V乙腈∶V水為1∶1)和甲醇+水(V甲醇∶V水為1∶1)的回收率相對(duì)較高。從極性角度考慮，水的極性大于甲醇，甲醇的極性大于乙腈，而草除靈是非極性物質(zhì)，應(yīng)選擇乙腈作復(fù)溶試劑，乙腈中加入適量水可大大提高復(fù)溶試劑的極性，更利于油脂基質(zhì)中草除靈的提取，所以選擇乙腈+水(V乙腈∶V水為1∶1)作復(fù)溶溶劑。

圖4 復(fù)溶溶劑對(duì)回收率的影響Figure 4 Effect of resolution solvent on recovery rate

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

由表3可知，油菜和油菜籽基質(zhì)中的草除靈離子化效率低于乙腈+水(V乙腈∶V水為1∶1)溶液中的，其基質(zhì)效應(yīng)為73%左右[13]，說(shuō)明基質(zhì)對(duì)草除靈有抑制作用。對(duì)于陽(yáng)性樣品而言，采用對(duì)應(yīng)的空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，草除靈離子化效率接近，可避免基質(zhì)效應(yīng)帶來(lái)的試驗(yàn)結(jié)果偏離，從而提高陽(yáng)性樣品數(shù)據(jù)測(cè)定的準(zhǔn)確性。

表3 草除靈的基質(zhì)效應(yīng)Table 3 The matrix effect of benazolin

2.5 檢出限、定量限、線性關(guān)系、準(zhǔn)確度及精密度

2.5.1 線性關(guān)系 用草除靈標(biāo)準(zhǔn)中間液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性方程為Y=3 085.8X-16 881(R2=0.999)，相關(guān)性良好。

2.5.2 檢出限與定量限 試驗(yàn)測(cè)得LC-MS方法的檢出限為0.008 mg/kg，定量限為0.027 mg/kg。

2.5.3 準(zhǔn)確度與精密度 由表4可知，在0.03，0.06， 0.15 mg/kg 添加水平下，油菜基質(zhì)中草除靈的平均回收率為86.3%～91.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.4%～6.7%；油菜籽基質(zhì)中草除靈的平均回收率為73.3%～84.2%，RSD為7.3%～8.7%。

表4 草除靈回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 The recovery rate and relative standard deviation of benazolin

3 結(jié)論

建立了一種適合油菜和油菜籽中草除靈的檢測(cè)方法。結(jié)果表明，以乙腈作為提取溶劑，石墨化炭黑—氨基復(fù)合柱凈化，C18柱分離，采用高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)定，該方法的前處理方便快捷、凈化完全、高效簡(jiǎn)便，且能夠得到較低的檢出限和較高的回收率，并能滿足日常檢測(cè)需求。有關(guān)其他類(lèi)似基質(zhì)中草除靈殘留量的檢測(cè)有待進(jìn)一步探究。