納米細菌在腎結石形成過程中的作用研究

楊恒 錢彪 鄭麗英 王勤章 郝志強 王敬珅 汪淵 李永樂 譚明輝 劉志立

[摘要]目的探究納米細菌（NB）損傷人腎小管上皮細胞 HK-2并導致晶體滯留的機制。方法應用腎結石患者尿液培養的 NB，實驗分為5組：對照組（胎牛血清、1640培養液+HK-2細胞）、NB 組（NB 菌液、胎牛血清、1640培養液+HK-2細胞）、COM 組（一水草酸鈣， COM 懸液、胎牛血清、1640培養液+HK-2細胞）、nHAP組（納米級羥基磷灰石，nHAP、胎牛血清、1640培養液+HK-2細胞）和四環素干擾組（TET+NB，四環素、NB 菌液、胎牛血清、1640培養液+HK-2細胞）。將 HK-2細胞分別與各組作用物共培養6、12、24 h 后，用光學顯微鏡觀察 HK-2細胞的形態學變化;超聲粉碎細胞后檢測 Na+-K+-ATP 酶和 Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性;檢測培養液中乳酸脫氫酶（LDH）、過氧化氫（H2O2）和丙二醛（MDA）含量。結果 HE 結果可見，nHAP組和四環素干擾組中 HK-2細胞的損傷程度明顯低于 NB 組（P <0.05）。共同培養12、24 h 后， NB 組和 COM 組 Na+-K+-ATP 酶和 Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性均低于對照組，H2O2含量均高于對照組（P <0.05），nHAP組 Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性均低于對照組（P <0.05），四環素干擾組 Na+-K -ATP 酶和 Ca+2+-Mg2+-ATP 酶活性均高于 NB 組（P <0.05）。共同培養6、12、24 h 后， NB 組和 COM 組 MDA 含量均高于對照組（P <0.05），四環素干擾組 MDA 含量均低于 NB 組（P <0.05）; COM 組 LDH 含量均高于對照組（P <0.05），nHAP組、四環素干擾組 LDH 含量均低于 COM 組（P <0.05）。結論 HK-2細胞損傷的原因可能是 NB 通過誘導脂質過氧化反應造成的， NB 作用時間越長，損傷程度越重。四環素在一定程度上可以阻止 NB 對 HK-2細胞的損傷。[關鍵詞]腎結石;納米細菌; HK-2細胞;脂質過氧化;四環素

[中圖分類號] R692.4? [文獻標識碼] A?? [文章編號]2095-0616（2022）07-0021-05

Investigation on the role of nanobacteria in the formation ofrenal calculi

YANG HengQIANbiao??? ZHENG Liying??? WANG QinzhangHAO? Zhiqiang1，2WANG? Jingshen1，2????? WANG? Yuan1，2????? LI? Yongle1，2????? TAN? Minghui1，2LIU? Zhili

1. Department of Urology， First Affiliated Hospital， School of Medcine， Shihezi University， Xinjiang， Shihezi 832000， China;2. First Affiliated Hospital of Gannan Medical University， Jiangxi， Ganzhou 341000， China

[Abstract] Objective To explore the mechanism of nanobacteria （NB） to damage human renal tubular epithelial HK-2 cells and lead to crystal retention. Methods The urine of patients with renal calculi was applied to culture NB. The experiment included five groups： the control group （fetal bovine serum， 1640 culture medium+HK-2 cells）， the NB group （NB bacterial solution， fetal bovine serum， 1640 culture medium+HK-2 cells）， the COM group （calcium oxalate monohydrate， i.e.， COM suspension， fetal bovine serum， 1640 culture medium+HK-2 cells）， the nHAP group （nano-hydroxyapatite， i.e.， nHAP， fetal bovine serum， 1640 culture medium+HK-2 cells） and the tetracycline （TET） interference group （TET+NB， tetracycline， NB bacterial solution， fetal bovine serum， 1640 culture medium+HK-2 cells）. HK-2 cells were co-cultured with each group of agents for 6 h， 12 h and 24 h， respectively， and then the morphological changes of HK-2 cells were observed by optical microscope. The activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase were detected after ultrasonic comminution to break cells. The contents of lactate dehydrogenase （LDH）， hydrogen peroxide （H2O2） and malondialdehyde （MDA） in the culture medium were detected. Results HE results showed that the damage degree of HK-2 cells in nHAP group and tetracycline interference group was significantly lower than that in NBgroup （P <0.05）.After co-culture for 12 and 24 h， the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase in NB group and COM group were lower than those in control group， and the content of H2O2 was higher than that in control group （P <0.05）. The activities of Ca2+-Mg2+-ATPase in the nHAP group werelower than those in the control group （P <0.05）， and the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+- ATPase in the tetracycline interference group were higher than those in the NB group （P <0.05）. After 6， 12， and 24 h of co-culture， the MDA content in the NB group and the COM group were higher than that in the control group （P <0.05）， and the MDA content in the tetracycline interference group was lower than that in the NB group （P <0.05）; the LDH content in the COM group was higher than that in the control group （P <0.05）， the LDH content in the nHAP group and the tetracycline interference group were lower than that in the COM group （P <0.05）. Conclusion The damage of HK-2 cells may be caused by NB-induced lipid peroxidation. The longer the action time of NB， the more serious the damage. Tetracycline can prevent NB from damaging HK-2 cells to a certain extent.

[Key words] Renal calculi; Nanobacteria; HK-2 cells; Lipid peroxidation; Tetracycline

腎結石在泌尿系結石中最常見，而腎結石中以草酸鈣結石最為常見[1]，在《黃帝內經》中稱之為石淋或者砂淋。目前對于該疾病的診斷和治療已經非常成熟，比如經尿道輸尿管鏡激光碎石取石術、經皮腎鏡鈥激光碎石取石術以及體外沖擊波碎石術，其中體外沖擊波碎石術相對患者來說不會造成損傷，由于術后恢復良好，許多患者傾向選擇該種方式[2];但其復發率較高，發病可表現為急癥，不僅導致患者疼痛難忍，并且增加社會經濟成本[3-4]。

芬蘭科學家Kajander首次在腎結石中發現并命名了納米細菌（nanobacteria， NB）， NB 是具有獨特的生物礦化功能致病菌，它可作為活性中心，通過自身生物礦化作用的同時，還依靠黏附血液中的鈣、磷等離子形成礦化顆粒，最終形成結石[5-6]。尿液中鈣鹽晶體形成后，會刺激腎小管上皮細胞發生病理性改變，致使腎小管上皮細胞發生炎癥反應和損傷，同時誘導細胞自噬能力增強[7]。四環素是為數不多可以有效抑制 NB 生長的藥物，易劍鋒等[8]相關研究表示，四環素對治療 NB 相關的慢性前列腺炎確有療效[9]。

有研究表明腎結石與NB 存在一定的相關性[7]，所以 NB 在腎結石形成過程中的作用及其機制的研究備受關注[10-12]。本課題旨在通過研究 NB 在腎結石形成過程中的作用及其機制。

1材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

實驗主要試劑及儀器見表1。

1.2? NB培養與鑒定

NB 培養與鑒定方法詳見褚浩等[6]的研究。1.3 實驗分組

選取 HK-2細胞，隨機分為5組： NB 組、對照組、C OM 組、nHAP組和四環素干擾組。見表2。

1.4 各組細胞HE染色觀察

分別在各時間點提取各組細胞，每組吸取100μl 細胞懸液，使用細胞離心涂片機進行涂片，PBS 沖洗3次，晾干;玻片經二甲苯脫蠟及梯度乙醇水化后，使用 Harris 蘇木精1 min，然后用自來水沖洗2 min，1%鹽酸乙醇分化5 s，伊紅染色5 min;再經梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片，于光學顯微鏡下觀察細胞形態變化。

1.5 細胞損傷因子指標檢測

①分別在6、12、24 h 取各組細胞上清液，按照試劑盒說明書分別檢測 H2O2、MDA、LDH 含量;②向吸進培養液的細胞中加入0.25%胰蛋白酶并反復吹打，將細胞消化，轉移至 EP 管中，分別加入 PBS 緩沖液400μl;③經超聲粉碎機粉碎，用 ATP 酶試劑盒（樣本前處理需高速離心）比色法測定各組細胞 ATP 酶活性。

1.6 統計學方法

運用 SPSS 24.0統計學軟件進行分析，符合正態分布計量資料以均數±標準差（x ± s）表示，使用完全隨機設計的方差分析，不符合正態分布的計量資料使用[M（P25， P75）]表示，采用非參數檢驗。 P <0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1 各組HE染色結果

NB 組部分細胞胞體膨脹增大，胞核松散，核膜模糊不清;對照組細胞形態大小均一，胞核清晰，胞漿致密，未見明顯異常;COM 組細胞數目明顯減少，胞核松散，部分核膜溶解，核仁消失;nHAP組細胞核膜較清晰，胞核更加致密;四環素干擾組大部分細胞形態規則、致密，胞核清晰部分細胞出現胞體膨脹，胞核松散。HE 染色結果見圖1。

2.2 各組細胞損傷因子指標檢測結果

NB 組和 COM 組共同培養12、24 h 后 Na+-K+-ATP 酶和 Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性均低于對照組;nHAP組共同培養12 h 后 Na+-K+-ATP 酶活性低于對照組、高于 COM 組， Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性低于對照組;nHAP組共同培養24 h 后 Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性低于對照組，高于 NB 組和 COM 組;四環素干擾素組共同培養12、24 h 后 Na+-K+-ATP 酶和 Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性均高于 NB 組，差異有統計學意義（P <0.05）。見表3。

對照組12、24 h 的 H2O2含量均低于 NB 組和 COM 組，四環素干擾組12 h 及24 h 的 H2O2含量低于 NB 組; COM 組6、12、24 h 的 LDH 含量時高于對照組，nHAP組和四環素干擾組在6 h 時 LDH 低于 NB 組和 COM 組，差異有統計學意義（P <0.05）; NB 組和 COM 組 MDA 含量均高于對照組，四環素干擾組顯著低于 NB 組，差異有統計學意義（P <0.05）。見表4。

3討論

腎結石形成的原因較多，目前尚不清楚[13-14]。鄧昊[15]總結腎結石形成有以下幾種假說：①血液經腎濃縮成尿液，尿液中的鹽類可形成結晶，在人體鈣磷代謝紊亂時出現結石;② Randall 實驗研究認為是礦物質結晶在腎乳頭處形成的鈣化斑塊導致結石形成;③部分人群未患尿結石是因為尿液中存在尿凝血酶原片斷1（UPTF1）等抑制物，當抑制物發生異常或減少時可形成結石。研究者認為原因可能為 Randall 腎乳頭鈣化斑學說和腎小管細胞損傷學說[16-17]。歸納以上結論不難看出，結石的形成來源于礦物質結晶鈣化，并且結晶可以深入腎小管間隙進一步破壞腎組織。腎結石中培養出 NB 的陽性率達90%以上，而 NB 具有獨特的生物礦化作用[18]，因此 NB 感染與腎結石存在一定相關性[19-20]。

NB 在生長增殖過程中能分泌羥磷灰石類的鈣化物[5]，因此，本研究設置 COM 組（5 mmol/L）和nHAP組作為對照，探究 NB 是否可對腎小管上皮細胞 HK-2產生損傷，并通過設置四環素干擾組進行驗證。HE 染色結果顯示各組對 HK-2破壞嚴重程度為 COM 組>NB 組>四環素干擾組>nHAP組>對照組，前兩組出現更多的胞體腫脹等現象， COM 組同樣表現核仁消失等現象。NB 組和nHAP組細胞膜亦可逐步解離，細胞刷狀緣排列錯亂。可見 NB 對腎小管的損害與 COM 相關性更大，直接分泌出的羥基磷灰石需凝結形成鈣化晶體從而進一步對細胞產生破壞，且四環素可通過抑制 NB 減少該損害。細胞因子損傷指標檢測結果顯示 COM 組和 NB 組 Na+-K+-ATP 酶和 Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性均降低，而 LDH 水平較高，提示 NB、COM 可損傷 HK-2的細胞膜，在 COM 組和 NB 組中有 H2O2和 MDA 水平的升高，提示 NB 在 HK-2細胞破壞過程中存在脂質過氧化反應。劉鑫等[7]研究表明大量活性氧自由基能造成腎小管上皮細胞損傷，且能增加晶體黏附力，形成惡性循環，加劇鈣化晶體沉積，形成腎結石。李軍等[21]選取60例 NB 感染的Ⅲ型前列腺炎患者平均分為四環素治療組和左氧氟沙星治療組，連續用藥1個月后，四環素治療組疼痛、排尿癥狀和生活質量評分顯著降低，差異有統計學意義（P <0.05）。

綜上所述，可通過聯合 Na+-K+-ATP 酶、Ca2+- Mg2+-ATP 酶活性及 LDH、H2O2和 MDA 含量的改變來判斷 NB 是否損傷 HK-2細胞。同時四環素可以減弱 NB 對 HK-2細胞的損害，因此四環素聯合其他藥物殺滅 NB 可能是腎結石患者的福音。

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（收稿日期：2021-04-06）