實時熒光定量PCR及新型冠狀病毒的檢測鑒定

王柯

（浙江中醫(yī)藥大學，浙江杭州 310053）

通過在PCR反應的體系中加入了熒光基團，接著利用熒光信號的累積實時監(jiān)測整個PCR的進程，最終通過標準曲線對未知模板進行定量分析的技術方法，就是實時定量PCR技術。由于常規(guī)PCR技術在應用過程中暴露出了許多問題，如假陽性的弊端、造成環(huán)境污染問題等，這些問題將會限制了PCR技術在臨床的進一步應用[1]。與常規(guī)PCR相比，它更加準確、特異、靈敏和快速，所以短時間內(nèi)就被廣泛應用到醫(yī)學、農(nóng)業(yè)等多個領域。本文將具體闡述實時熒光定量PCR及初步說明檢測鑒定新型冠狀病毒中的作用。

1. 實時熒光定量PCR的簡要介紹

1.1 TaqMan探針

TaqMan探針為一寡核苷酸，在其兩端分別用一個報告熒光基團以及一個淬滅熒光基團進行標記。當探針完整的時候，淬滅基團吸收報告基團所發(fā)射的熒光信號。進行延伸反應時，探針會被聚合酶的5′-3′外切酶活性切斷，使得熒光基團與淬滅基團分離開，繼而能夠發(fā)射出熒光。一分子的產(chǎn)物的產(chǎn)生，同時也就伴隨著一分子的熒光信號產(chǎn)生，隨著擴增循環(huán)的數(shù)目不斷增加疊加，所釋放出來的熒光基團也不斷積累并增加，最后我們根據(jù)熒光強度可定量分析。新型TaqMan-MGB探針，其3′端標記的熒光淬滅基團是一種幾乎無熒光本底的小溝結合物，使其特異性、靈敏度、穩(wěn)定性都有所提高。該技術既可進行基因定量分析，又可以應用于單核苷酸多態(tài)性檢測（SNP）和多重病原體檢測等領域。

1.2 SYBR熒光染料

熒光染料的檢測方法是非特異性檢測的一種方法，PCR反應體系中的總核酸量通過此方法能夠被反應，主要包括溴化乙錠、SYBR GreenⅠ等。當熒光染料與雙鏈DNA結合之后，其熒光將增強，但是沒有摻入鏈中的SYBR染料分子不會放射任何的熒光信號，因此熒光的增強程度與復制的進行是同步關聯(lián)的。SYBR熒光染料的優(yōu)越性體現(xiàn)在操作簡單、靈敏性高、通用性強、經(jīng)濟等方面。只要測定PCR反應液中的熒光強度，就可以對目標基因進行定量分析，目標基因的Tm值也可以通過此方法測定出來。在使用過程中需把握熒光染料的濃度，若濃度過低，擴增的樣品可能無法檢出。若濃度過高，SYBR GreenⅠ則又可以抑制PCR反應，進而降低PCR反應速率，可以采取合適的Mg2+濃度來對抗它對反應的抑制作用。

1.3 分子信標

分子信標帶有莖環(huán)結構，是一種雙標記寡核苷酸探針，也是一種TaqMan探針的衍生形式。由于其兩側(cè)的核酸序列是互補配對的，會導致熒光基團與淬滅基團相互貼近，因而無法產(chǎn)生熒光。但在退火進程中，分子信標中間的部分會與特定的DNA序列進行配對并結合，使得熒光基因與淬滅基因相分離產(chǎn)生熒光。分子信標的靈敏度高、操作簡便，被用于生物學和生物分析等領域，對基因突變所引起的疾病、活細胞RNA及蛋白質(zhì)的檢測發(fā)揮著很大作用。

分子信標的靈敏度要比其他同長的寡核苷酸探針高，它適用于檢測點突變，僅有一個核苷酸差別的DNA序列也能得到區(qū)分，其弊端在于與模板結合的穩(wěn)定性較差。從分子信標首次提出以來，它在很多重要的生化分析領域中扮演著越來越重要的角色[2]。

2. 新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）及檢測方法

2.1 SARS-CoV-2的及其特點

2019年12月，新型冠狀病毒在武漢城爆發(fā)，該病毒的所致癥狀通常為發(fā)燒、乏力、干咳等，逐漸發(fā)展為呼吸困難，嚴重者表現(xiàn)為ARDS，甚至膿毒癥休克，以及難以恢復的代謝性酸中毒還有凝血功能的障礙，其傳播途徑為呼吸道飛沫傳播和接觸傳播。該病毒因其危害性大且傳染性強，有潛伏期，沒有相關特異的治療方法，目前新型冠狀病毒肺炎在全世界范圍內(nèi)蔓延。

新型冠狀病毒是引起此次新型冠狀病毒肺炎的病原體，屬于β屬冠狀病毒，其基因組為單鏈RNA。新冠肺炎疫情傳播非常迅速，感染面很廣，防控的難度很大。但是目前我們對于新型冠狀病毒的來源還不是非常確定，存在著諸多爭議。SARS-CoV-2還有很多的變異株，如奧密克戎等，其快速的變異性更是對控制新冠起了巨大的阻礙作用。

2.2 SARS-CoV-2的檢測

檢測SARS-CoV-2的特異核酸序列，首先要將SARSCoV-2核酸（RNA）逆轉(zhuǎn)錄為DNA，再用多聚酶鏈反應的方法將DNA進行擴增，用來檢測特定的基因序列。PCR是擴增DNA的方法，是將篩選出的具有特異性的新冠病毒部分特有的相關基因片段作為靶標DNA，這種序列的擴增是是一種指數(shù)級的擴增。每一個新擴增出來的DNA序列，我們都可預先就加入的一段熒光標記得探針結合，用于產(chǎn)生熒光信號。擴增過程中擴增出來的基因愈多，累計的熒光信號就越強，以此方法可以確定樣本中是否有病毒的核酸，也就是表示受檢者是否感染[3]。

國家衛(wèi)生健康委辦公廳關于印發(fā)《新型冠狀病毒肺炎診療方案》和《新型冠狀病毒肺炎防控方案》中指出，熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR可以快速檢測病人標本中的SARSCoV-2 RNA[4]。其步驟包括標本采集、試劑與儀器準備、提取RNA、RT-q PCR等。

確診感染的最重要指標之一是進行新型冠狀病毒核酸的檢測，如何確保檢測的精準性是實驗室目前的重點。診斷試劑、核酸檢測質(zhì)量體系是較令人注意的內(nèi)容，在標本取材的方面質(zhì)量控制通過“內(nèi)標”RNase P的設置是一種較好監(jiān)控是否采集到足夠量的細胞的方法。但是核酸RNA在取材后的降解這方面卻容易被忽略，也是由于各式各樣的取材管，無統(tǒng)一的標準與要求，后期的核酸檢測結果就容易出現(xiàn)假陰性的現(xiàn)象[5]。

在RT-PCR的實驗過程中，為防止陽性核酸的污染，進行試劑配制、核酸抽提、核酸擴增等需要進行分區(qū)處置。并將陽性結果進行復測，或在核酸重新抽提后復測，因此在檢測的過程中，建議加入dUTP以及UNG酶的防污染系統(tǒng)[6]。

傳統(tǒng)當中的實時熒光定量RT-PCR的檢測方法需要進行加樣、核酸提取、離心等生物安全風險系數(shù)較大的步驟，同時在新冠病毒核酸的檢測在樣品的保存等實驗內(nèi)容、實驗室中人員操作的熟練程度、生物安全意識等方面有著較高需求。目前隨著分子診斷內(nèi)容的廣泛開展，其核酸提取擴增檢測一體化的實時熒光定量PCR儀不斷在臨床中得到應用[7]。

2.3 數(shù)字PCR

現(xiàn)在運用廣泛的熒光定量PCR（RT-PCR）在檢測SARS-CoV-2方面可能會存在“假陰性”的結果，存在需要多次取樣、重復檢測等缺陷，因此亟需建立一種靈敏度更高、樣本用量更少、操作更簡單的檢測方法，以快速、精確的方式篩查出患者。數(shù)字PCR作為一種新興的痕量核酸分子技術，它不僅有靈敏度高、耐受性強的特點，也擁有可以絕對定量等優(yōu)點，在病毒檢測的領域中受到廣泛應用。同時，數(shù)字PCR對反應抑制劑的耐受性比較強、受到背景野生DNA分子干擾小，當樣本珍貴、病毒載量低、樣本核酸存在降解時，數(shù)字PCR優(yōu)勢明顯。迅速、便捷、準確地監(jiān)測環(huán)境中的病毒也是數(shù)字PCR的一大特點，早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早治療，對維護全球公共衛(wèi)生安全具有顯著的深遠影響[8]。

然而我國的數(shù)字PCR技術存在著諸多弊端，例如缺乏共性理論的研究，與數(shù)字PCR方法的發(fā)展實際聯(lián)系不夠貼近。若要應用于臨床研究，數(shù)字PCR方法尚未獲得監(jiān)管部門許可，這也許是造成醫(yī)療衛(wèi)生等范疇無任何有關標準的主要原因。我國數(shù)字PCR方法與標準的國際化存在一定的差距，原因是未引起對其國際標準化的重視[9]。

2.4 病毒基因測序

基因測序作為一種新型的基因檢測技術，它能夠通過血液或唾液分析測定基因序列，從而預測病毒感染等疾病的可能性，根據(jù)與已知的新型冠狀病毒是否高度同源，進而判斷是否感染新冠病毒。

2.5 存在問題與對策

新冠的標本在采集完成后如果存在標本蓋沒有擰緊或者由于傾倒轉(zhuǎn)輸?shù)倪^程中經(jīng)過劇烈震蕩搖晃的情況也可以造成交叉污染。正因如此，在日常工作當中就應該制訂有關標本采集的相關標準操作程序，加強對相關人員的系統(tǒng)培訓與考核，確保標本在采集、運輸、保存等各個途徑中都沒有被污染的可能性。核酸檢測也需要在符合生物安全的實驗室進行，所有設備例如生物安全柜、離心機等，若被陽性質(zhì)粒或陽性標本所污染，就可以導致假陽性的結果出現(xiàn)，儀器的性能如果不佳也會造成擴增出現(xiàn)假陽性。除此之外，實驗室的污染、核酸檢測的人員防護意識以及防污染的意識不夠強，或者其對實驗標準操作的規(guī)程不熟悉，也容易導致污染，最終使結果出現(xiàn)假陽性的情況[10]。

RT-PCR的檢測的可信度比較高，但在最開始也存在假陰性的問題。實際上核酸檢測呈現(xiàn)假陰性的原因有：研發(fā)的試劑盒質(zhì)量并不是很高，經(jīng)過改進以后，這一方面的短板得以解決，患者在做前幾次檢測時，病毒也許沒有充分侵入人體。所以說，有人經(jīng)多次檢測才查出病毒核酸陽性的結果[3]。其解決方法有：標本采集進行標準化培訓，并且提高試劑盒的質(zhì)量控制，增加檢測明確性質(zhì)，對出院患者進行密切隨訪等。核酸檢測假陰性的情況同樣需要被重視，所以必須重視輕癥患者的出院標準，同時提高治愈出院的標準[11]。

2.6 展望

對SARS-CoV-2核酸的RT-PCR檢測，以及利用病毒基因測序與已知的新型冠狀病毒高度同源等方法途徑作為臨床確診的主要判斷依據(jù)，防控疫情取得了較好的效果[12]。PCR的熒光定量PCR、數(shù)字PCR等診斷技術各有其優(yōu)劣之處，因此它們適用于不同的條件。在目前實時熒光定量PCR的發(fā)展是較為完善的，在臨床檢測中適用面較廣泛。在醫(yī)院、第三方檢測機構等場所，熒光定量PCR是SARS-CoV-2檢測的主要手段，然而其檢測效率會被假陰性所制約，檢出率不高。數(shù)字PCR可以定量檢測病毒的拷貝數(shù)目，且靈敏度要高于熒光定量PCR，對于恢復期患者低病毒載量的上呼吸道的樣本，數(shù)字PCR仍可以檢出SARS-CoV-2，但其檢測的成本高，且操作相對繁雜，難以普及[13]。

本土疫情已基本得到控制，但由于境外疫情的發(fā)展以及國內(nèi)局部地區(qū)新冠疫情時有發(fā)生，面臨著新冠肺炎輸入疫情的境地與存在著疫情反彈的風險，面臨恢復正常生產(chǎn)需求、生活秩序的迫切需要等問題，新冠疫情防控的形勢依然十分嚴峻[14]，全球新冠肺炎疫情以及連帶效應，給全世界的人民帶來的是多重危機。為了有效面對并戰(zhàn)勝疫情所帶來的危機，構建人類命運共同體的迫切性與重要性更加能夠得到凸顯[15]。其診斷方法依然是當下的研究的重中之重，我們?nèi)孕枰咛禺愋院挽`敏度、低成本易操作且時間短的診斷方法。相信隨著不斷的深入研究，新型可靠的診斷技術將不斷滿足臨床當中的需求，更好地為患者生命得健康保駕護航[12]。