CKD-Ⅴ期糖尿病腎病患者血管鈣化與血清CTRP3、VK2水平的關系

黃國威，肖李艷，袁仲飛

重慶市開州區人民醫院腎內科，重慶405400

糖尿病腎病（DN）是糖尿病最常見的微血管并發癥，以腎小球濾過率進行性下降和（或）持續性白蛋白尿為主要特征，是導致終末期腎病的主要原因［1］。有研究報道，慢性腎臟病Ⅴ期（CKD-Ⅴ期）維持性血液透析患者心血管事件的發生率較健康人群顯著升高，其心血管事件除與高血壓、高血脂、家族史等經典危險因素有關外，還與血管鈣化密切相關［2］。目前，血管鈣化的發生機制尚未完全闡明，臨床亦缺乏有效的預防和干預措施。王云丹［3］研究認為，血管平滑肌細胞（VSMC）向成骨細胞分化可能與血管鈣化的發生密切相關。補體1q/腫瘤壞死因子相關蛋白3（CTRP3）是一種新發現的脂肪因子，可通過上調成骨標記物表達，促進VSMC 向成骨細胞分化［4］。維生素K2（VK2）是一種脂溶性維生素，可通過維生素K 依賴蛋白限制鈣磷晶體生長，抑制VSMC凋亡，從而抑制其向成骨細胞分化［5］。但二者是否與CKD-Ⅴ期DN患者血管鈣化有關尚不完全清楚。本研究探討了CKD-Ⅴ期DN患者血管鈣化與血清CTRP3、VK2水平的關系，旨在為臨床早期預防和干預CKD-Ⅴ期DN患者心血管事件的發生提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年1月—2020年12月重慶市開州區人民醫院收治的CKD-Ⅴ期DN 患者103例。DN診斷依據《中國成人糖尿病腎臟病臨床診斷的專家共識》［6］，CKD-Ⅴ期診斷依據估算的腎小球濾過率（eGFR）＜15 mL/（min·1.73 m2）。納入標準：①符合CKD-Ⅴ期DN 診斷標準；②年齡18～80 歲；③病歷資料完整。排除標準：①近6 個月內接受激素或免疫抑制劑治療者；②近6個月內有骨折史者；③近3 個月內有急性感染史或急性心腦血管疾病者；④合并急性腎損傷、原發性或繼發性腎小球疾病者；⑤合并甲狀腺或甲狀旁腺疾病者；⑥合并自身免疫性疾病者；⑦合并血液系統疾病者；⑧合并惡性腫瘤者；⑨既往有血運重建史者。其中，男76例、女27例，年 齡42～78（65.05 ± 6.10）歲，BMI 19～28（24.07 ± 2.35）kg/m2，糖尿病病程5～17（10.16 ±2.33）歲。根據CT血管成像檢查是否存在血管鈣化分為有鈣化組33 例和無鈣化組70 例。本研究經重慶市開州區人民醫院倫理委員會批準［批準文號：202102（ZP）］，所有研究對象或其家屬知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2 血清CTRP3、VK2檢測 所有研究對象入院次日采集清晨空腹肘靜脈血6 mL，置于真空采血管中，3 000 r/min離心20 min、離心半徑8 cm，留取上層血清，置于-80 ℃冰箱保存。采用酶聯免疫吸附法檢測血清CTRP3、VK2。試劑盒購自上海欽誠生物科技有限公司，所有操作嚴格按照試劑盒說明進行。

1.3 血管鈣化積分評估 所有研究對象入院12 h內采用柯達DR7500 數字X 線攝影系統拍攝骨盆正位片和雙手正位片，參照ADRAGAO 等［7］標準評估血管鈣化積分。骨盆正位片通過水平線和垂直線將骨盆分為四部分，水平線位于股骨頭切面，垂直線位于脊柱位置。雙手正位片先以雙手各作為一部分，再以掌骨上方水平線分隔為四部分。上述八部分每個部位根據有無鈣化分別計1或0分，總分0～8 分。積分越高，血管鈣化越嚴重。X 線片由兩位經驗豐富的放射科醫師采用雙盲法獨立閱片，結果不一致時協商解決。

1.4 資料收集分析 收集所有研究對象入院24 h內一般臨床資料、實驗室檢查資料及eGFR。一般臨床資料包括性別、年齡、BMI、糖尿病病程、吸煙史（≥1支/天，連續≥6個月）、血壓（收縮壓、舒張壓），實驗室檢查資料包括血脂（TC、TG、HDL-C、LDL-C）、空腹血糖（FPG）、血鈣、血磷、甲狀旁腺激素（PTH）、CTRP3、VK2 水 平。根 據Cockcroft-Gault 公 式 計 算eGFR，eGFR=（140-年齡）×體質量/（Scr×72），女性按計算結果×0.85，其中年齡以歲為單位、體質量以kg為單位、Scr以mg/dL為單位。比較兩組一般臨床資料、實驗室檢查資料及eGFR，將有統計學差異的指標納入多因素Logistic 回歸模型，分析CKD-Ⅴ期DN患者發生血管鈣化的危險因素。

1.5 統計學方法 采用SPSS26.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，結果比較采用獨立樣本t檢驗；偏態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，結果比較采用U檢驗。計數資料比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Pearson 相關分析法。危險因素分析采用多因素Logistic 回歸模型。預測效能分析采用受試者工作特征（ROC）曲線。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清CTRP3、VK2水平比較 有鈣化組血清CTRP3、VK2 水平分別為（79.77±9.23）、（3.12±0.58）μg/L，無鈣化組分別為（69.08±6.46）、（3.89±0.81）μg/L。有鈣化組血清CTRP3 水平明顯高于無鈣化組，血清VK2 水平明顯低于無鈣化組（t分別為-6.795、-4.916，P均＜0.01）。

2.2 CKD-Ⅴ期DN 患者有血管鈣化者血清CTRP3、VK2水平與血管鈣化積分的關系 CKD-Ⅴ期DN 患者有血管鈣化者血管鈣化積分為（3.15±1.20）分。Pearson 相關分析顯示，CKD-Ⅴ期DN 患者有血管鈣化者血清CTRP3 水平與血管鈣化積分呈正相關關系（r=0.634，P＜0.01），而血清VK2 水平與血管鈣化積分呈負相關關系（r=-0.687，P＜0.01）。

2.3 CKD-Ⅴ期DN 患者發生血管鈣化的危險因素分析 有鈣化組男24例、女9 例，有吸煙史11 例；無鈣化組男52例、女18例，有吸煙史15例。兩組性別構成、有吸煙史比例比較差異均無統計學意義（χ2分別為0.028、1.684，P均＞0.05）。兩組其他臨床資料比較見表1～3。

表1 兩組一般臨床資料比較（±s）

表1 兩組一般臨床資料比較（±s）

組別有鈣化組無鈣化組t P n 33 70年齡（歲）66.61±5.81 64.31±6.14 1.798＞0.05 BMI（kg/m2）24.55±2.08 23.84±2.45 1.421＞0.05糖尿病病程（年）10.82±2.35 9.84±2.27 2.012＜0.05收縮壓（mmHg）159.72±28.60 158.90±27.49 0.140＞0.05舒張壓（mmHg）89.52±27.50 87.42±25.80 0.377＞0.05

表2 兩組血脂、血糖水平比較（mmol/L，±s）

表2 兩組血脂、血糖水平比較（mmol/L，±s）

組別有鈣化組無鈣化組t P n 33 70 TC 5.16±1.20 4.81±0.87 1.680＞0.05 TG 1.97±1.10 1.68±0.88 1.438＞0.05 HDL-C 1.32±0.28 1.44±0.26 2.075＜0.05 LDL-C 3.42±0.84 3.10±0.78 1.896＞0.05 FPG 6.23±1.36 5.25±1.46 3.244＜0.05

表3 兩組eGFR、血鈣、血磷、PTH水平比較

以CKD-Ⅴ期DN 患者是否存在血管鈣化（是=1，否=0）為因變量，以糖尿病病程、HDL-C、FPG、血鈣、血磷、PTH、CTRP3、VK2 為自變量，納入多因素Logistic回歸模型。結果顯示，PTH、CTRP3為CKD-Ⅴ期DN 患者發生血管鈣化的獨立危險因素，而VK2則為其獨立保護因素（P均＜0.05）。見表4。

表4 CKD-Ⅴ期DN患者發生血管鈣化的多因素Logistic回歸分析結果

2.4 血清CTRP3、VK2水平對CKD-Ⅴ期DN患者發生血管鈣化的預測價值 ROC 曲線分析顯示，血清CTRP3水平預測CKD-Ⅴ期DN患者血管鈣化的曲線下面積（AUC）為0.826（95%CI：0.739～0.894），最佳截斷值為70.97 μg/L，此時其預測CKD-Ⅴ期DN患者發生血管鈣化的靈敏度為87.88%、特異度為65.71%、準確度為72.81%；血清VK2水平預測CKD-Ⅴ期DN 患者發生血管鈣化的AUC為0.786（95%CI：0.694～0.860），最佳截斷值為3.59 μg/L，此時其預測CKD-Ⅴ期DN 患者發生血管鈣化的靈敏度為78.79%、特異度為70.00%、準確度為73.01%；血清CTRP3、VK2 水平聯合預測CKD-Ⅴ期DN 患者發生血管鈣化的AUC為0.903（95%CI：0.828～0.952），其預測CKD-Ⅴ期DN患者發生血管鈣化的靈敏度為84.85%、特異度為78.57%、準確度為80.58%。血清CTRP3、VK2水平聯合預測CKD-Ⅴ期DN患者發生血管鈣化的AUC明顯大于血清CTRP3、VK2水平單獨預測（Z分別為2.377、3.117，P均＜0.05）。見圖1。

圖1 血清CTRP3、VK2水平預測CKD-Ⅴ期DN患者發生血管鈣化的ROC曲線

3 討論

血管鈣化是CKD-Ⅴ期DN 最常見的病理表現，超過50% CKD-Ⅴ期DN 患者可發生血管鈣化。血管鈣化可增加血管壁僵硬度并降低其順應性，易引起血管破裂、血栓形成等，從而使CKD-Ⅴ期DN患者心血管事件的發生率明顯升高［2］。目前，血管鈣化的發生機制尚不完全清楚。長期以來，血管鈣化被認為是一個不可避免的病理過程。但近年研究證實，血管鈣化是一個與骨礦化相似的、由細胞介導的主動調節過程，在一定條件刺激下，骨髓源性細胞、血管周圍細胞、VSMC 向軟骨或成骨樣細胞分化是血管鈣化的中心環節［3］。VSMC 既是血管壁的主要細胞成分，也是成骨細胞的重要來源。VSMC 凋亡可釋放具有較高堿性磷酸酶活性的囊泡，形成堿性鈣磷沉積微環境，增加羥基磷灰石沉積，啟動血管鈣化；同時，氧化應激、炎癥、高糖、高鈣、高磷等刺激可改變VSMC 表型，使其收縮表型轉變為合成表型，增強鈣化相關蛋白的合成能力，從而促進血管鈣化［8］。

CTRP3 是脂聯素類似物CTRP 脂肪因子家族中的一員，主要表達于脂肪組織，其表達水平易受飲食、藥物、運動等因素影響，能夠以內分泌形式通過機體循環在多種器官或組織中發揮生物學作用。HU 等［9］研究表明，CTRP3能夠減弱高糖誘導的腎小球系膜細胞功能障礙，過表達CTRP3 則可抑制腎小球系膜細胞增殖和細胞外基質、活性氧產生，進而抑制DN 進展。CTRP3 還具有抗炎和促進新生血管生成等作用，在心血管疾病中發揮保護作用［10］。但在成熟軟骨細胞中CTRP3 表達顯著降低，而在分化軟骨組織中表達顯著升高，外源性給予CTRP3 能夠呈劑量依賴性地促進軟骨祖細胞和軟骨細胞增殖［11］，提示CTRP3 可能參與軟骨細胞分化。而軟骨細胞分化與血管鈣化密切相關，由此推測CTRP3 可能參與血管鈣化的發生。SCHAFFLER 等［12］研究表明，過表達CTRP3可通過自分泌和旁分泌激活p38絲裂原活化蛋白激酶、細胞外調節激酶1/2 信號通路而促進VSMC 增殖，從而參與血管鈣化。本研究結果顯示，有鈣化組血清CTRP3 水平明顯高于無鈣化組，提示CTRP3 可參與血管鈣化，與SCHAFFLER等［12］研究報道一致。進一步研究發現，CKD-Ⅴ期DN 患者有血管鈣化者血清CTRP3 水平與血管鈣化積分呈正相關關系，并且血清CTRP3水平是CKD-Ⅴ期DN 患者發生血管鈣化的獨立危險因素，結果提示CTRP3 能夠參與CKD-Ⅴ期DN 患者血管鈣化的發生，但與CTRP3 在DN 和心血管疾病中的保護作用相悖。FREISE等［13］研究發現，在慢性腎衰誘導的腹主動脈鈣化血管中CTRP3 表達顯著升高，而體外高磷培養下過表達CTRP3可上調VSMC核心結合因子α1、骨橋蛋白、骨形態發生蛋白2 等成骨表型標記物表達，促進VSMC 成骨樣分化，從而參與血管鈣化，但單獨CTRP3 在體和離體條件下均不會引起血管鈣化。DN患者由于腎小管功能減退，引起鈣磷潴留，而CKD-Ⅴ期DN患者已達到腎臟病晚期，鈣磷排泄進一步降低，高鈣磷通過Wnt 活性引起血管鈣化［13］。本研究結果亦證實，有鈣化組血磷水平明顯高于無鈣化組，結合ZHOU 等［14］研究報道，我們推測CTRP3 自身無法引起血管鈣化，而是促進血管鈣化的重要因素。劉海玲等［15］研究亦報道，血清CTRP3水平與因胸痛入院檢查患者冠狀動脈鈣化無關，進一步提示CTRP3 導致血管鈣化可能與DN 患者高鈣磷環境有關，但其具體機制有待于進一步研究。本研究多因素Logistic 回歸分析顯示，血鈣和血磷并不是CKD-Ⅴ期DN 患者發生血管鈣化的獨立危險因素，這可能與DN患者均已進展至CKD-Ⅴ期，腎功能已降至最低，鈣磷排泄差異并不顯著有關。

維生素K 是一種脂溶性維生素，天然存在形式有VK1、VK2兩種。有研究報道，VK2可通過增加胰島素樣生長因子1、堿性磷酸酶活性，分化成骨細胞和磷酸化骨鈣素，從而促進骨形成。近年研究發現，基質Gla 蛋白（MGP）、生長停滯特異性基因產物6（Gas6）、循環抗凝物蛋白、凝血級聯反應的凝血因子等維生素K 依賴性蛋白的γ 羧化均需要VK2 參與［16］。MGP 主要表達于軟骨細胞和VSMC，能夠與胎球蛋白A 組成復合物結合鈣磷，在局部結合轉化生長因子β和骨形態發生蛋白2，阻止鈣化相關的信號傳導，其功能發揮依賴γ羧化修飾，而該過程依賴維生素K 參與［17］。Gas6 可通過γ 羧化提升Bcl-2 活性，抑制VSMC 凋亡，進而抑制其向成骨細胞轉分化［18］。作為γ 羧化的主要參與者，當VK2 缺乏時，Gas6 不能刺激Bcl-2 活性，不能發揮抑制血管鈣化的作用。有研究證實，高劑量維生素K 補充可減輕華法林治療后引起的血管鈣化［19］。本研究結果顯示，有鈣化組血清VK2 水平明顯低于無鈣化組，提示VK2 能夠參與血管鈣化的發生，其原因可能與CKD-Ⅴ期DN患者乳制品攝入量較少有關。乳制品為VK2 的主要來源，有鈣化組病情更嚴重，食欲和胃腸功能吸收較差，其體內VK2 水平明顯降低。早在CKD-Ⅲ期DN 患者每日營養物質攝入就已降低，而治療情況、并發癥、尿毒癥毒性物質均會影響維生素K吸收、利用和排泄，故全球改善腎臟疾病預后組織建議DN 患者健康飲食應以富含豆類、水果、蔬菜、植物蛋白、全谷類食物為主［20］。進一步研究發現，CKD-Ⅴ期DN 患者有血管鈣化者血清VK2 水平與血管鈣化積分呈負相關關系，血清VK2 水平為血管鈣化發生的獨立保護因素，提示血清VK2 水平升高能夠抑制KD-Ⅴ期DN患者血管鈣化的發生。

本研究ROC 曲線分析顯示，當血清CTRP3、VK2水平分別為70.97、3.59 μg/L時，其預測CKD-Ⅴ期DN 患者血管鈣化發生的AUC分別為0.826、0.786，二者聯合預測CKD-Ⅴ期DN患者血管鈣化發生 的AUC為0.903，提 示CTRP3、VK2 均 可 作 為CKD-Ⅴ期DN 患者血管鈣化發生的預測指標，而二者聯合時預測價值更高。

綜上所述，CKD-Ⅴ期DN 患者發生血管鈣化后血清CTRP3 水平明顯升高，血清VK2 水平明顯降低。血清CTRP3 水平為CKD-Ⅴ期DN 患者發生血管鈣化的獨立危險因素，而血清VK2 水平則為其獨立保護因素。血清CTRP3、VK2 水平對CKD-Ⅴ期DN患者發生血管鈣化均有一定預測價值，二者聯合時預測價值更高。