miR-142-5p靶向調控RPN2對膠質瘤細胞增殖、侵襲的影響及其機制

張士俊，王延民，吳煥成，胡群亮，靳春杰

1 天津市北辰醫院神經外科，天津300400；2 天津醫科大學總醫院神經外科

膠質瘤是中樞神經系統最常見的腫瘤，全球膠質瘤年發病率為4.6/10萬～5.7/10萬，近年來其發病率呈明顯上升趨勢［1］。膠質瘤的治療方法以外科手術為主，術后輔以放化療，但目前仍難以徹底治愈［2］。膠質瘤的發病機制至今仍不完全清楚。因此，深入探索膠質瘤發生、發展的分子機制對其早期診斷和靶向治療意義重大。微小RNA-142-5p（miR-142-5p）基因定位于人17 號染色體，能夠結合下游靶基因mRNA 的3′非編碼區，在轉錄后水平調控基因的表達［3］。有研究報道，胰腺癌、肺癌等惡性腫瘤細胞miR-142-5p 表達下調，其表達下調可導致下游促癌基因過表達，如磷脂酰肌醇-3-激酶，從而促進腫瘤細胞惡性增殖［4-6］。核糖蛋白2（RPN2）基因定位于人20 號染色體，其編碼蛋白位于粗面內質網，可參與分泌蛋白的轉運。有研究發現，在結直腸癌、胃癌等惡性腫瘤細胞中RPN2 表達上調，并通過激活AKT 信號通路促進腫瘤細胞增殖和遷移［7-8］。近年有學者報道，RPN2 mRNA 的穩定性受miR-128、miR-378e 等miRNA 的轉錄后表達調控［8-9］。但在膠質瘤細胞中RPN2 mRNA 表達及其調控機制尚不清楚。2017 年1 月—2018 年1 月，本研究探討了miR-142-5p 靶向調控RPN2 對膠質瘤細胞增殖、侵襲的影響及其機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人膠質瘤細胞系U251、U87、T98G 和正常星形膠質細胞株HA1800（以下分別稱U251、U87、T98G、HA1800 細胞），購自美國ATCC。所有引物序列及pmirGLO-RPN2-野生型（WT）、pmirGLO-RPN2-突變型（MUT）、miR-142-5p mimic 和RPN2 過表達質粒由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。ABI7500 實時熒光定量PCR 儀，購自美國ABI 公司；酶標儀，購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；Transwell 小室，購自美國Corning 公司。Vimentin 單克隆抗體、RPN2多克隆抗體、β-catenin單克隆抗體、GSK3-β 單克隆抗體，購自美國Abcam 公司；E-cadherin 多克隆抗體、N-cadherin 多克隆抗體，購自美國Proteintech 公司。MTT 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒，購自美國Promega 公司；miRNA RNeasy Plus試劑盒，購自德囯Qiagen 公司；反轉錄試劑盒、2×SYBR Green PCR Mastermix 試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，購自美國Promega公司。

1.2 細胞傳代培養 將U251、U87、T98G、HA1800細胞接種于含10%FBS的DMEM培養基，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。每周換液2或3次。待細胞生長融合80%～90%時，0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2或1∶3傳代。取傳15代、對數生長期、生長狀態良好的細胞進行后續試驗。

1.3 miR-142-5p、RPN2 mRNA 表達檢測 采用熒光定量PCR 法。取傳15 代、對數生長期、生長狀態良好的U251、U87、T98G、HA1800 細胞，采用TRIzol法抽提細胞總RNA，經NanoDrop1000超微量分光光度計鑒定，提取的總RNA 濃度和純度合格。按反轉錄試劑盒說明，將總RNA 反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，按2×SYBR Green PCR Mastermix 試劑盒說明進行PCR 擴增。引物序列：miR-142-5p 上游引物5′-CAUAAAGUAGAAAGCACUACU-3′、下 游 引 物5′-UAGUGCUUUCUACUUUAUGUU-3′，U6 上游引物5′-AGTAGTGCTTTCUACTTTACG-3′、下游引物5′-CAGCACCCCCGAGTAGTACAA-3′；RPN2 上 游引物5′-TGGCCCTGACAATCATAGCC-3′、下游引物5′-GAGTCCCACGATGGAGTAGAA-3′，GAPDH 上游引物5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′、下游引物5′-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′。miR-142-5p 的PCR 反應體系共10 μL：cDNA 模板1 μL，SYBR Green Mastermix 5 μL，上下游引物各1 μL，雙蒸水2 μL；反應條件：95 ℃15 s，95 ℃10 s、60 ℃40 s、70 ℃10 s共35個循環。RPN2 mRNA的PCR反應體系共20 μL：cDNA 模板2 μL，上下游引物各1 μL，SYBR Green Mastermix 10 μL，雙蒸水6 μL；反應條件：95 ℃1 min，95 ℃20 s、62 ℃30 s、72 ℃30 s共30個循環。擴增反應結束，繪制熔解曲線，收集循環閾值（CT）數。以U6 或GAPDH 為內參，采用2－ΔΔCT法計算miR-142-5p、RPN2 mRNA相對表達量。

1.4 miR-142-5p 靶向調控RPN2 預測與驗證 借助生物信息學軟件TargetScan7.2（http：//www. targetscan. org/vert_72/），預測miR-142-5p 與RPN2 的靶向結合位點。取傳15 代、對數生長期、生長狀態良好的人膠質瘤細胞接種于24 孔板，每孔5 × 104個，隨機分為RPN2-WT 組、RPN2-MUT 組、miR-142-5p mimic + PN2-WT 組、miR-142-5p mimic + RPN2-MUT組，然后置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。當細胞生長融合80%～90%時，RPN2-WT 組轉染pmirGLO-RPN2-WT，RPN2-MUT 組轉染pmirGLO-RPN2-MUT，miR-142-5p mimic + RPN2-WT 組 轉 染miR-142-5p mimic 和pmirGLO-RPN2-WT，miR-142-5p mimic + RPN2-MUT 組 轉 染miR-142-5p mimic和pmirGLO-RPN2-MUT。轉染48 h，收集各組細胞，按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明檢測各組熒光素酶活性。

1.5 細胞增殖活性檢測 采用MTT 法。取傳15代、對數生長期、生長狀態良好的人膠質瘤細胞接種于6 孔板，每孔1 × 106個，隨機分為對照組、miR-142-5p 組、RPN2 組、miR-142-5p + RPN2 組，然后置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。當細胞生長融合80%～90%時，miR-142-5p 組轉染miR-142-5p mimic，RPN2 組轉染RPN2 過表達質粒，miR-142-5p + RPN2 組 轉 染miR-142-5p mimic 和RPN2 過表達質粒，對照組僅加入轉染試劑。轉染48 h，0.25%胰蛋白酶消化后，收集細胞，以每孔1×103個細胞密度鋪至96 孔板，繼續培養。分別于培養0、24、48、72 h，每 孔 加 入5 mg/mL MTT 溶 液20 μL，37 ℃孵育2 h，吸棄上清液，加入DMSO 200 μL，輕輕振蕩混勻，使結晶物完全溶解。酶標儀于450 nm 波長處檢測各孔的光密度（OD）值。以OD450值代表細胞增殖活性。

1.6 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell 侵襲實驗。將Matrigel 膠用培養基按1∶8 稀釋，取40 μL 稀釋后的Matrigel 膠包被Transwell 小室上室，37 ℃靜置2 h，基底膜下室面用PBS 水化1 h。取各組上述轉染48 h細胞，用無血清培養液重懸，調整細胞懸液密度為1 × 105/mL。取細胞懸液200 μL 加入Transwell 小室上室，下室加入含20%FBS 的DMEM 培養基500 μL。然后將Transwell小室置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱培養。培養16 h，取出Transwell 小室，輕輕拭去上室面未穿膜細胞，4%多聚甲醛固定30 min，0.5%結晶紫染色15 min，倒置相差顯微鏡下拍照觀察。隨機選取5個400倍視野，計數穿膜細胞數。以穿膜細胞數代表細胞侵襲能力。

1.7 Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。取各組上述轉染48 h 細胞，加入含PMSF 的RIPA 裂解液，冰上裂解10 min，提取細胞總蛋白。經BCA 法蛋白定量合格后，加入5×SDS-Loading 上樣緩沖液，95 ℃金屬浴10 min，使蛋白充分變性。取變性蛋白50 μg，SDS-PAGE 分離（濃縮膠恒壓80 V，分離膠恒壓120 V）。電泳結束，將蛋白電泳產物轉印至PVDF 膜上（轉膜恒流250 mA 90 min）。5% BSA 室溫封閉2 h，分別加入β-catenin、p-GSK3-β、N-cadherin、Vimentin、E-cadherin、GAPDH 一抗，4 ℃孵育過夜。次日，加入生物素標志的羊抗兔二抗，室溫孵育1 h。ECL 發光，暗室內曝光、顯影，ChemiScope 3300 mini 軟件拍照分析。以GAPDH 為內參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.8 統計學方法 采用SPSS19.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人膠質瘤細胞和正常星形膠質細胞miR-142-5p、RPN2 mRNA 表達比較 各細胞miR-142-5p、RPN2 mRNA 相對表達量比較見表1。由于人膠質瘤U251、U87、T98G 細胞miR-142-5p 和RPN2 mRNA相對表達量兩兩比較P均＞0.05，選擇miR-142-5p相對表達量最低、RPN2 mRNA相對表達量最高的人膠質瘤U251細胞進行后續實驗。

表1 人膠質瘤細胞和正常星形膠質細胞miR-142-5p和RPN2 mRNA相對表達量比較（±s）

表1 人膠質瘤細胞和正常星形膠質細胞miR-142-5p和RPN2 mRNA相對表達量比較（±s）

注：與HA1800細胞比較，*P＜0.05。

?細胞類型HA1800細胞U251細胞U87細胞T98G細胞miR-142-5p 1.89±0.23 0.29±0.05*0.33±0.06*0.36±0.07*RPN2 mRNA 0.40±0.10 2.25±0.30*2.04±0.32*1.91±0.33*

2.2 miR-142-5p與RPN2的靶向調控關系 經在線生物信息學軟件TargetScan7.2預測，RPN2 mRNA的3′非編碼區第93～99位堿基存在與miR-142-5p的靶向結合位點，見圖1。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，RPN2-WT組、RPN2-MUT組、miR-142-5p mimic+RPN2-WT組、miR-142-5p mimic+RPN2-MUT組熒光素酶活性分別為3.20 ± 0.34、3.40 ± 0.33、0.65 ±0.12、3.11±0.30。miR-142-5p mimic+RPN2-WT組熒光素酶活性明顯低于RPN2-WT組、RPN2-MUT組、miR-142-5p mimic + RPN2-MUT 組（P均＜0.05），而RPN2-WT 組、RPN2-MUT 組、miR-142-5p mimic +RPN2-MUT組熒光素酶活性兩兩比較P均＞0.05。

圖1 miR-142-5p與RPN2的靶向結合位點示意圖

2.3 各組細胞增殖活性比較 見表2。

表2 各組細胞增殖活性比較（±s）

表2 各組細胞增殖活性比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與miR-142-5p組比較，＃P＜0.05；與RPN2組比較，△P＜0.05。

組別對照組miR-142-5p組RPN2組miR-142-5p+RPN2組細胞增殖活性（OD450值）培養0 h 0.31±0.07 0.32±0.09 0.30±0.08 0.30±0.07培養24 h 0.51±0.12 0.48±0.09 0.62±0.14 0.58±0.10培養48 h 0.82±0.17 0.53±0.18*1.18±0.23*＃0.85±0.19＃△培養72 h 1.13±0.20 0.83±0.12*1.51±0.27*＃1.20±0.22＃△

2.4 各組細胞侵襲能力比較 對照組、miR-142-5p組、RPN2 組和miR-142-5p+ RPN2 組侵襲細胞數分別 為（93.35 ± 20.34）、（40.65 ± 7.12）、（167.40 ±30.15）、（103.28 ± 20.30）個。與對照組比較，miR-142-5p組侵襲細胞數明顯減少，RPN2組侵襲細胞數明顯增多（P均＜0.05），而miR-142-5p+RPN2組侵襲細胞數變化不明顯（P＞0.05）；與miR-142-5p組比較，RPN2組和miR-142-5p+RPN2組侵襲細胞數明顯增多（P均＜0.05）；與RPN2組比較，miR-142-5p+RPN2組侵襲細胞數明顯減少（P＜0.05）。

2.5 各組Wnt/β-catenin 信號通路相關蛋白表達比較 見表3。

表3 各組Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白相對表達量比較（±s）

表3 各組Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白相對表達量比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與miR-142-5p組比較，＃P＜0.05；與RPN2組比較，△P＜0.05。

組別對照組miR-142-5p組RPN2組miR-142-5p+RPN2組β-catenin 1.12±0.17 0.62±0.11*1.90±0.28*＃0.71±0.17△p-GSK3-β 0.61±0.08 0.32±0.09*1.82±0.14*＃0.58±0.14＃△N-cadherin 0.63±0.07 0.33±0.08*1.78±0.25*＃0.85±0.19＃△Vimentin 0.53±0.08 0.23±0.12*1.64±0.27*＃0.70±0.22＃△E-cadherin 0.62±0.12 1.25±0.24*0.20±0.04*＃0.53±0.12＃△

3 討論

膠質瘤是神經系統最常見的腫瘤，占所有顱腦腫瘤的40%～50%。近年來，隨著生活節奏的加快，膠質瘤的發病率逐年上升［10］。膠質瘤的臨床治療較為棘手，通常以外科手術為主，術后輔以放化療，但治療后復發率較高［11］。目前，膠質瘤的發病機制尚不完全清楚。因此，深入探索膠質瘤發生、發展的分子機制對其早期診斷和靶向治療意義重大。

非編碼RNA 是一類具有基因表達調控功能的RNA 分子，包括miRNA、長鏈非編碼RNA 及環狀RNA 等。miRNA 是長度為19～25 個核苷酸的內源性非編碼RNA，成熟的miRNA 具有莖環結構，可參與形成RNA 誘導的沉默復合物，從而抑制下游靶基因的表達。miR-142-5p 基因定位于人染色體17q22，正好位于t（8；17）易位的染色體脆性位點區域。有研究報道，miR-142-5p可在炎癥、非酒精性脂肪肝以及腫瘤等疾病的發生、發展過程中發揮重要作用［12-13］。miR-142-5p 表達下調可導致其下游癌基因胰島素樣生長因子結合蛋白3 表達增加，通過促進腫瘤細胞上皮間質轉化而促進腫瘤惡性進展［14］。本研究結果發現，U251、U87、T98G 細胞miR-142-5p相對表達量明顯低于HA1800 細胞，提示膠質瘤細胞miR-142-5p 表達下調。目前，膠質瘤細胞miR-142-5p 表達下調的分子機制尚不清楚。SU 等［15］研究發現，長鏈非編碼RNA TUG1 可作為分子支架結合并抑制miR-142-3p 表達，進而上調其下游HMGB1、Rac1 等基因的表達。ZHU 等［16］研究證實，在胰腺癌組織中miR-142-5p 可靶向負調控核酪蛋白激酶和細胞周期蛋白依賴性激酶底物1，進而下調AKT磷酸化水平，從而抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移。為進一步研究miR-142-5p 的生物學功能，本研究通過轉染miR-142-5p mimic 觀察了miR-142-5p對膠質瘤細胞增殖和侵襲的影響，結果發現，過表達miR-142-5p 后，膠質瘤細胞增殖和侵襲能力均明顯受到抑制。提示在膠質瘤中miR-142-5p 可作為一種抑癌基因參與抑制腫瘤惡性進展。

RPN2 基因定位于人染色體20q11.23，其編碼蛋白是一種跨膜糖蛋白，可通過糖基化修飾作用調控蛋白的穩定性和分泌，在細胞信號傳導過程中發揮關鍵作用［17］。研究表明，RPN2 在腫瘤干細胞中高表達，并通過調節CD36 的N-糖基化來促進乳腺癌細胞惡性增殖［18］。本研究結果發現，U251、U87、T98G 細胞RPN2 mRNA 相對表達量均明顯高于HA1800 細胞，提示膠質瘤細胞RPN2 表達上調，這可能與RPN2 表達受轉錄和轉錄后水平調控有關。RODRIGUEZ等［19］研究報道，賴氨酸和雌二醇能夠直接促進RPN2轉錄，導致RPN2表達上調，進而促進乳腺癌惡性進展。有研究發現，在膠質瘤中miR-442a能夠靶向抑制RPN2 表達，抑制Wnt/β-catenin/轉錄因子4 信號通路傳導，從而抑制膠質瘤細胞增殖和侵襲［20］。結合上述miR-142-5p 對RPN2 的靶向調控作用，我們推測在膠質瘤中RPN2 表達也可能受miR-142-5p 的靶向調控。為了驗證這一推論，我們通過在線生物信息學軟件TargetScan7.2 預測發現，RPN2 mRNA 的3′非編碼區第93～99位堿基存在與miR-142-5p的靶向結合位點。進一步通過雙熒光素酶報告基因實驗驗證，miR-142-5p 能夠靶向調控RPN2 mRNA表達。因此，在膠質瘤細胞中miR-142-5p 可能通過靶向抑制RPN2 表達，從而發揮抑癌基因作用。進一步研究發現，RPN2 過表達后，膠質瘤細胞增殖和侵襲能力均明顯增強。此外，RPN2 過表達后，膠質瘤細胞中Wnt/β-catenin 信號通路的關鍵蛋白β-catenin、p-GSK3-β、N-cadherin、Vimentin 表達升高，而E-cadherin 表達降低。結果表明RPN2 可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路，從而促進腫瘤細胞上皮間質轉化，繼而增強膠質瘤細胞的增殖和侵襲能力。而共轉染RPN2 過表達質粒和miR-142-5p mimic后，膠質瘤細胞的增殖和侵襲能力明顯降低，提示miR-142-5p 能夠逆轉RPN2 過表達引起的腫瘤促進作用，其機制可能與共轉染miR-142-5p mimic和RPN2過表達質粒能夠抑制Wnt/β-catenin信號通路激活有關。

綜上所述，miR-142-5p 能夠靶向抑制RPN2 表達，從而抑制膠質瘤細胞增殖和侵襲，其作用機制可能與調控Wnt/β-catenin信號通路傳導有關。