桃紅四物湯對兔軟骨損傷模型Smad1信號轉導蛋白表達的影響

孫云柯 李益亮 姚金龍 孫紹裘

[摘要]目的探討桃紅四物湯對不同程度兔軟骨損傷模型Smadl信號轉導蛋白表達的影響，從而闡明桃紅四物湯干預Smad1信號轉導蛋白表達促進軟骨損傷修復作用機制。方法將40只健康新西蘭大白兔，適應性喂養1周后，按照隨機的方法平均分成四組，分別為桃紅四物湯組、氨基葡萄糖組、模型組和正常對照組，每組各10只。對桃紅四物湯組、氨基葡萄糖組和模型組進行軟骨損傷造模，術后分別以桃紅四物湯、氨基葡萄糖對對應組灌胃，模型組、正常對照組灌服等量生理鹽水，并于灌胃后4周、6周兩個時限，從每組隨機抽取5只實驗兔，麻醉后抽取腹主動脈血，并按原手術切口切開后暴露損傷軟骨，進行大體觀察，并切取包括股骨下端在內的關節面，檢測Smad1信號轉導蛋白表達情況，予以統計分析。結果桃紅四物湯組平均血清Smad1濃度明顯高于氨基葡萄糖組、模型組，但是低于正常對照組;WB檢測的平均灰度值測定第4周時低于氨基葡萄糖組，但明顯高于模型組，第6周時則高于氨基葡萄糖組;各組大白兔關節軟骨組織HE染色病理觀察，第4周與第6周差異不大。結論桃紅四物湯能上調軟骨損傷模型大白兔Smad1信號轉導蛋白的表達，促進軟骨損傷修復，并且上調效果優于氨基葡萄糖。

[關鍵詞]桃紅四物湯;氨基葡萄糖;軟骨損傷;Smadl信號轉導蛋白

[中圖分類號]R285.5??? [文獻標識碼]A??? [文章編號]2095-0616（2022）01-0020-05

Effect of Taohong Siwu Decoction on the expression of Smadl signal transduction protein in rabbit model with cartilage injury

SUN Yunke1，2??? LI Yiliang1??? YAO Jinlong1?? ?SUN Shaoqiu2

l.Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410208，China;2. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410005，China

[Abstract]Objective To explore the effect of Taohong Siwu Decoction on the expression of Smad1 signal transduction protein in rabbit model with cartilage injury of different degrees，so as to clarify the mechanism of Taohong Siwu decoction intervening the expression of Smad1 signal transduction protein and promoting cartilage injury repair. Methods A total of 40 healthy New Zealand white rabbits were randomly divided into 4 groups after adaptive feeding for 1 week，namely Taohong Siwu Decoction group，glucosamine group，model group and normal control group，with 10 rabbits in each group. The models with cartilage injury were made in Taohong Siwu Decoction group，glucosamine group and model group. After operation，Taohong Siwu Decoction and glucosamine were given to the corresponding groups respectively，and the model group and normal control group were given the same amount of normal saline. Five experimental rabbits were randomly selected from each group within four weeks and six weeks after gastric perfusion. After anesthesia，abdominal aorta blood was collected. The injured cartilage was exposed observed generally throng cutting the original surgical incision，and the articular surface，including the lower end of the femur，was incised，and the expression of Smad1 signal transduction protein was detected and statistically analyzed. Results The average concentration of serum Smad1 in Taohong Siwu Decoction group was significantly higher than that in glucosamine group and model group，but lower than that in normal control group. Western Blot （WB）detection showed that the average gray value in Taohong Siwu Decoction group was lower than that of glucosamine group at the 4th week，but significantly higher than that of model group，and higher than that of glucosamine group at the 6th week. Pathological observation of articular cartilage tissue of rabbits in each group by hematoxylin-eosin （HE）staining showed little difference between the 4th week and 6th week. Conclusion Taohong Siwu Decoction can up-regulate the expression of Smad1 signal transduction protein in rabbit model of cartilage injury and promote the repair of cartilage injury，and the up-regulation effect is better than glucosamine.

[Key words] Taohong Siwu Decoction;Glucosamine;Cartilage injury;Smad1 signal transduction protein

軟骨損傷根據損傷深度的差異可分為以下兩類：部分厚度的軟骨損傷和全層關節軟骨損傷，前者為缺骨鈣化層，后者則為缺損超過軟骨鈣化層[1]。按照國際軟骨修復協會（International Cartilage Repair Society，ICRS）分級法來劃分：0級表示為正常關節軟骨;I級體現為軟骨腫脹、軟化;II級即軟骨表面缺損<軟骨全層的50%;III級則為軟骨表面缺損超過全層的50%，軟骨下骨未顯露;IV級為全層軟骨損傷，表現為軟骨下骨裸露甚至缺損[2]。現階段普遍認為軟骨能夠修復的程度與其損傷的類型有關，<2.0 mm的損傷通常會觀察到相似于正常透明軟骨的修復組織;軟骨缺損的直徑>3 mm則很難完全修復;直徑>6 mm的全層軟骨損傷不僅無法修復，還會進一步累及到周圍的骨質和軟骨，從而使缺損面積進一步擴大，繼續發展還可引起損傷周邊的軟骨出現下滑甚至塌陷[3]。

在我國傳統中醫學中暫無獨立的對關節軟骨損傷這類病證的研究，中醫講“筋”包括關節軟骨;筋附著于骨的表面，因而筋與骨兩者之間的關系緊密且相互影響;因而將關節軟骨損傷歸類于傳統中醫學的“筋傷”“骨痹”的范疇[4]。傳統中醫學認為軟骨損傷后，損傷局部首先會出現氣滯血瘀，經絡的氣血循行受阻，進而影響了軟骨正常的營養供應，局部軟骨組織失去濡養，最終導致機體的功能出現異常，從而引發一系列病理改變。因此，本項目組認為軟骨損傷的病機多為氣滯血瘀。

1??? 實驗與方法

1.1??? 動物及分組

實驗選取雌雄新西蘭大白兔各20只，10～12月齡，體重2.5～3 kg/只，共40只，由本大學動物實驗中心統一購買[實驗動物許可證SCXK（湘）2020- 0005]。隨機分為桃紅四物湯組、氨基葡萄糖組、模型組和正常對照組，各組大白兔適應性喂養1周后開始進行造模，其中除正常對照組只切開皮膚進行假手術外，其余各組均按下文所述造模方法進行造模。

1.2??? 灌胃試劑制備

桃紅四物湯：參照《醫宗金鑒》[5]中桃紅四物湯的方藥組成，桃仁20 g、川芎10 g、當歸20 g、紅花10 g、赤芍20 g、生地黃20 g。中藥材均按《中華人民共和國藥典》[6]所載道地藥材的指定主產地由本大學第二附屬醫院藥劑科一次購進，由煎藥房代煎，水煎制成含生藥4 g/ml的湯劑，并置于冰箱冷藏。桃紅四物湯灌胃劑量的計算：根據人與動物體表面積換算公式，予以4.7 g/kg灌胃。

氨基葡萄糖：選用鹽酸氨基葡萄糖片（正大清江制藥，國藥準字H20060647，規格：0.75 g×30片），充分研磨，溶于水中，配置成濃度為0.015 g/ml的溶液。氨基葡萄糖灌胃劑量的計算：根據人與動物體表面積換算公式，予以0.07 g/kg灌胃。

1.3??? 造模方法

實驗大白兔禁食水6 h以后，整理好手術器械，消毒實驗臺，準備造模。準備電子秤，稱取重量，抓取大白兔，消毒后用5 ml的注射器按體重3.5 ml/kg抽取相應10%水合氯醛緩慢行腹腔麻醉，注射過程中注意回抽，無血方能繼續注射，避免水合氯醛直接入血，導致大白兔死亡。當大白兔出現肌肉松弛，且角膜反射消失后即表示深入麻醉，麻醉成功，可以進行實驗。實驗過程中，動作溫柔輕緩，并注意觀察大白兔胸廓起伏情況，確保實驗大白兔的生命體征平穩。大白兔取仰臥位，用固定器將實驗大白兔固定于手術臺，充分暴露術野，首先對手術區域進行備皮，切口選擇膝關節內側，依次切開皮膚、分離皮下筋膜，找到髕骨內側緣，以此為切口切開膝關節，牽拉肌腱，充分暴露關節區域，在股膝關節槽處進行手術造模，其中部分軟骨損傷采用刀片輕輕地刮蹭軟骨表面;全層軟骨損傷則用刀片去掉全部的軟骨，并輕輕刮擦下骨板;骨軟骨損傷則選用手搖鉆，鉆孔穿透軟骨下骨，深度為3.5～4 mm。所有缺損直徑均約4 mmo造模結束后對關節囊、肌肉筋膜組織嚴密縫合，最后縫合皮膚，對齊皮緣。術畢碘伏消毒，術后禁食6 h后標準動物飼料喂養。

1.4??? 實驗儀器

移液器Finnpipette，20～200μl（德國艾本德公司）;培養箱37°（一恒蘇凈科學公司）;洗板機Tianshi，988洗板機（拓普分析儀器）;酶標儀（雷杜生命科學公司）;離心機：微量高速離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）;冷凍離心機：TGL16M（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）;恒溫搖床（赫田科學儀器公司）;攪拌器：81-2恒溫磁力攪拌器（世紀科信科學儀器公司）。

1.5??? 檢測標本制備

含藥血清的制備：參考實驗動物與人體表面積計算方法進行計算。桃紅四物湯組給予每日桃紅四物湯4.7 g/kg灌胃，分為早上9點和下午4點兩次灌胃;氨基葡萄糖組給予每日氨基葡萄糖0.07 g/kg灌胃，分為早上9點和下午4點兩次灌胃;模型組與正常對照組分別予以等量的生理鹽水灌胃。后分別于第4周、第6周抽取大白兔腹主動脈血，離心后置于-20℃下保存備用。

骨標本制備：切取包括股骨下端在內的關節面，然后予以股骨頭進行切片、固定、包埋、染色等處理后，置于顯微鏡下觀察，余下骨組織進行WB 檢測。

1.6??? 標本檢測方法

含藥血清中Smad1酶聯免疫分析：各標準品孔加入不同濃度的標準品50 μl，設置空白孔和待測品孔。在酶標包被板上待測品孔中加入樣品稀釋液40 μl，再加入待測品10 μl（最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，注意不觸及孔壁，最后輕輕搖勻。經加酶、溫浴、配液、洗滌后加入顯色劑A 50 μl，第二步為入顯色劑B 50 μl，搖勻，避光顯色15 min（溫度37℃），最后加入種植液，空白孔調零，測量各孔的OD值。

Western Blotting檢測：對各組細胞進行培養收集，提取蛋白，按照BCA蛋白定量試劑盒使用說明操作，測定蛋白濃度，之后按照Western Blotting法制膠、準備、電泳、轉膜、封閉、孵育、顯色、曝光，檢測Smadl信號轉導蛋白表達水平。

HE染色：骨標本脫鈣后，將切片放置恒溫箱（60℃）烤片1～2 h，之后二甲苯浸泡10 min，浸泡2次，再依次在100%、100%、95%、85%和75%梯度乙醇中，放置5 min，蒸餾水浸洗5 min后用蘇木素浸染10 min，沖洗后PBS返藍，伊紅浸染5 min后沖洗;最后梯度乙醇（95%～100%）脫水各5 min，再置于二甲苯10 min，2次，予中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，拍照。

1.7??? 統計學分析

實驗數據采用SPSS 22.0統計學軟件，多組間差異性分析采用方差檢驗，組內兩兩比較采用LSD-t檢驗，配對資料兩組間差異性分析采用配對樣本t檢驗，定義檢驗水準為α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

2??? 結果

2.1??? 各組股骨下端的關節面進行大體觀察

對照組軟骨面光滑平整，全層形態結構正常，其余各組關節面均不平整，其中桃紅四物湯與氨基葡萄糖兩組軟骨修復情況均明顯優于模型組，且桃紅四物湯對骨軟骨損傷模型的修復表現優于其他兩類軟骨損傷模型。

2.2??? Western Blotting對于各組標本中Smad1信號轉導蛋白水平的表達

第4周時桃紅四物湯組低于氨基葡萄糖組，第6周時則高于氨基葡萄糖組（P<0.05），兩組均低于正常對照組，但均高于模型組（P<0.05）。見圖1及表1。

2.3??? 各組實驗動物血清樣本Smad1酶聯免疫分析

第4周、第6周桃紅四物湯組均高于氨基葡萄糖組（P<0.05），兩組均低于正常對照組，但均高于模型組（P<0.05）。見表2。

2.4??? 關節軟骨組織HE染色病理觀察

桃紅四物湯組表面區不平整，高低不平，軟骨基質增生，膠原纖維增生，輻射層軟骨細胞減少，血管侵犯潮線;氨基葡萄糖組表面區不平整，高低不平，軟骨基質增生，膠原纖維增生，血管侵犯潮線;模型組移行區軟骨細胞含量降低，雙重潮線;對照組表面區光滑平整，全層形態結構正常，潮線明顯。第4、6兩周各組對比差異不大。見圖2。

3??? 討論

骨形態發生蛋白（bonemorphogeneticprotein，BMP）通過經典和非經典兩類Smad信號通路來發揮調控誘導作用[7]，其中Smads蛋白作為BMP下游中重要的經典信號蛋白，具有不同的特性[8]，根據其不同特性可分為以下幾類，第1類包括Smad1、2、3、5、8;其中Smad2、Smad3稱為受體活化型，可傳遞TGF-B 信號，而Smad1、5、8則可與受體形成復合物相結合并使其磷酸化，介導BMP信號轉導[9]。第2類為Co-Smads，即Smad4，它可同時存在BMPs和TGF-P 信號通路中，為合作關系[10]。第3類為I-Smads，包括Smad6、7。I-Smads不能被受體磷酸化，但可與R-Smads競爭，阻止其磷酸化，起到負調控作用。

Smad1作為BMP信號傳遞過程中重要的信號轉導蛋白，其下游在BMP信號傳遞過程中起到重要作用的兩個轉錄因子為Runx2、Sox9，二者均與調控成骨細胞、軟骨細胞的分化關系密切[11]。研究發現，敲除小鼠Smad1基因后，小鼠骨量下降且出現顱骨發育遲緩的現象，BMP信號通路被抑制[12]。

綜上所述，BMP-Smad信號通路與軟骨再生具有密切的聯系，且Smad1信號轉導蛋白作為信號通路中重要的蛋白，其表達對促進軟骨損傷的修復有著重要意義，對促進軟骨細胞的分化有著重要的作用。在傳統中醫學中并無單一對關節軟骨缺損病證的認識研究，關節軟骨在傳統醫學中歸屬于“筋”;骨與筋相互聯系、相互影響;因此關節軟骨損傷在中國傳統醫學中可診斷為“筋傷”“骨痹”[13]。中醫骨傷認為軟骨損傷后，損傷局部會出現氣滯血瘀的表現，經絡氣血循行障礙;局部組織失去營養供應，正常的生理功能出現異常。氣血虧虛，不能充盈血脈，氣無以帥血正常達于四肢關節，脈絡運行無力，駐留于關節化為瘀血，關節失養，瘀血阻滯經絡，痹阻關節，不通則痛。此“痹久必有瘀血”;痹病日久，加之風寒濕邪侵襲經絡，氣血不能貫通暢行，痹阻經絡，瘀結而發為痹痛[14]。活血化瘀法為治療痹證的基本方法，桃紅四物湯作為活血化瘀的代表方之一，其有效性在臨床上已得到了證實。

研究表明活血化瘀藥物內服可以明顯升高骨折局部骨組織中BMP-7、Smad1、Smad5mRNA的表達水平[15]，而Smad1、5與軟骨再生修復密切相關[16]。段洪超等[17]研究發現丹參注射液可修復退變軟骨，減少軟骨細胞凋亡，保護關節軟骨。余毅[18]研究發現活血化瘀中藥能有效緩解軟骨細胞的破壞程度。劉獻祥等[19]發現用透骨消痛顆粒含藥血清可以促進Sox9m RNA等因子的表達，陳國茜等[20]研究發現活血化瘀含藥血清可通過調控Wnt/β-catenin信號通路影響MSCs的軟骨分化，以上研究均在一定程度上進一步證明了活血化瘀藥物對促進軟骨損傷修復的作用。

該實驗以不同程度軟骨損傷模型大白兔為研究對象，對各組實驗標本進行檢測分析，實驗表明桃紅四物湯能上調軟骨損傷模型大白兔Smad1信號轉導蛋白的表達，并且上調效果總體優于氨基葡萄糖，第4周、第6周各組間無明顯差異;大體觀察顯示桃紅四物湯極有可能對骨軟骨損傷模型的修復效果更好。本實驗從分子層面再次證明了桃紅四物湯對軟骨損傷修復的作用，并在一定程度上闡述了Smad1信號轉導蛋白表達促進軟骨損傷修復的作用機制，但受到組別樣本數量的限制，其確切機制以及桃紅四物湯的最適軟骨損傷模型仍需進一步研究。

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