焦磷酸測序對藥品中5種致病菌的快速鑒定方法

李秀珍 劉風琴 王芳 郭樹靜

[摘要]目的建立焦磷酸測序對藥品中5種致病菌的快速鑒定方法。方法通過信息網站及專業設計軟件設計引物，擴增后進行電泳與焦磷酸測序，測序結果與Genebank庫相應基因序列進行比對。結果5種致病菌測序結果與Genebank庫相應基因序列匹配率均在93%以上，均能得到良好的鑒定結果。結論焦磷酸測序方法可以實現對5種致病菌的快速鑒定，大大提高鑒定效率。

[關鍵詞]焦磷酸測序;5種致病菌;通用引物;快速鑒定

[中圖分類號]R969;R446.5??? [文獻標識碼]A??? [文章編號]2095-0616（2022）01-0055-04

Rapid identification of five pathogenic bacteria in drugs by pyrosequencing

LI Xiuzhen??? LIU Fengqin??? WANG Fang??? GUO Shujing

Department of Biological Testing，Dezhou Food and Drug Inspection and Testing Center，Shandong，Dezhou 253000，China

[Abstract]Objective To establish a rapid identification method for five pathogenic bacteria in drugs by pyrosequencing. Methods Primers were designed through information website and professional design software，and then electrophoresis and pyrosequencing were conducted after the amplification of primers. The sequencing results were compared with the corresponding gene sequences in Genebank library. Results The sequencing results of the five pathogenic bacteria matched the corresponding gene sequences of the Genebank library by more than 93%，and all of them could be identified well. Conclusion The method of pyrosequencing can realize the rapid identification of five pathogenic bacteria and greatly improve the identification efficiency.

[Key words]Pyrosequencing;Five pathogenic bacteria;Universal primer;Rapid identification

隨著人們對微生物快速鑒定的重視，建立一種快速準確的致病菌鑒定方法成為研究熱點[1-2]。傳統的鑒定方法主要是表型微生物鑒定法，其操作煩瑣，耗時長，受主觀因素影響較大[3-5]，且可能存在因受損微生物不能完整表達其表型屬性，而被正確鑒定分類的情況[6]。焦磷酸測序（pyrosequencing）技術是新一代脫氧核糖核酸（DNA）序列分析技術，克服了傳統培養技術的不足，具有敏感快速、操作簡便、分析結果更加全面、準確等優勢[7-9]，可應用于多個領域的病原菌快速檢測[10]。目前，應用焦磷酸測序對微生物進行鑒定，大多需要使用不同的引物。對于同一樣本，想要排查多種致病菌時，需要多次重復操作，費時費力。通過研究，本研究建立5種常見致病菌（副溶血性弧菌、單核細胞增生李斯特菌、福氏志賀氏菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌）快速鑒定方法。采用一條通用引物，一次鑒定可同時排查5種致病菌，大大提高鑒定效率。現報道如下。

1??? 材料與方法

1.1??? 材料

1.1.1??? 標準菌株??? 選取福氏志賀菌ATCC12022、金黃色葡萄球菌ATCC6538、單核細胞增生李斯特菌ATCC19115、副溶血性弧菌ATCC17802、阪崎腸桿菌ATCC29544、沙門氏菌ATCC14028、大腸0157 ATCC35150共7種常見致病菌株，均為德州市食品藥品檢驗檢測中心購買標準菌株。菌株復蘇后接種于相應的增菌培養基中過夜培養。

1.1.2??? 主要儀器和試劑??? 儀器：刀式研磨儀GM200、冷凍高速離心機FRESCO21、核酸蛋白測定儀QIAxpert、基因擴增儀ETC811、QIAxcel Advanced全自動核酸分析系統、實時定量焦磷酸序列分析儀PyroMark Q48 Autoprep。測序軟件及版本號為PyroMark Q48 Autoprep 2.4.2。試劑：PowerFood Microbial DNA Isolation kit購于凱杰企業管理（上海）有限公司、PyroMark PCR Kit（200）購于凱杰企業管理（上海）有限公司、PyroMark Q48 advanced CpG Reagents購于凱杰企業管理（上海）有限公司、擴增及測序引物購于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2??? 方法

1.2.1??? 引物的設計與合成利用基因庫數據檢索網站美國國家生物信息中心（NCBI）及焦磷酸測序儀配套專業軟件，設計測定通用引物，進行致病菌的鑒定。通用引物為：上游引物F：5TCGATGCAACGCGAAGAA 3，下游引物R：5ACATTTCACAACACGAGCTGACGA 3，測序引物S：CGCGAAGAACCTTACC，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2??? 細菌DNA的提取??? 取1.8 ml上述各細菌過夜培養物（或樣品中分離的各純菌落過夜培養物）至2 ml收集管中，13 000 r/min離心1 min，棄上清，按照PowerFood Microbial DNA Isolation kit 提取試劑盒操作說明，提取上述各細菌DNA模板備用。

1.2.3??? PCR（聚合酶鏈反應）反應體系及擴增程序PCR反應體系的配制??? 擴增反應體積為25 μl，分別為：10×CoralLoad Concentrate 2.5 μl，2×PyroMark PCR Master Mix 12.5 μl，引物（5 μmol/L）各1μl，模板DNA（50～200 ng/μl）2 μl，加滅菌去離子水至25 μl;擴增程序：95℃-15 min，94℃-30 s，60℃-30 s，72℃-30 s，45個循環，72℃-10 min，4℃保存。

1.2.4??? 電泳取PCR產物??? 利用QIAxcel Advanced 全自動核酸分析系統進行毛細管電泳。

1.2.5??? 測序??? 按照焦磷酸測序儀操作規程進行操作，按照（ATCG35個循環）進行噴射，單端測序，根據儀器提示在試劑艙相應位置加入所需產物、底物、酶和A、C、G、T等，按照儀器操作提示進行測序。

2??? 結果

2.1??? 擴增產物電泳結果

將PCR產物進行毛細管電泳，均能得到100 bp左右的擴增片段條帶。見圖1～3。

2.2??? 擴增產物焦磷酸測序結果

將擴增后產物進行焦磷酸測序，測序后其中5種致病菌均能得到良好的測序結果。見圖4～8。

2.3??? 測序比對結果

將上述5種致病菌測序結果與標準序列進行比對，測得序列與標準序列幾乎一致，均能得到良好的比對結果。見圖9～13。

以上5種致病菌經同一引物進行擴增，擴增后進行測序，測得序列（以上擴增后測序結果，均為原結果，由測序序列去除兩端引物區，未進行拼接與剪切，未進行任何修飾與改動）與Genebank庫相應基因序列進行比對，匹配率（identities）均在93%以上，均能得到良好的鑒定結果。

3??? 討論

3.1??? 當前研究狀況

3.1.1??? 方法設計??? 本研究利用微生物特異性與保守型更強的V3、V4、V5、V6區分別進行引物設計，旨在尋求一條通用引物，可以同時對更多菌株進行焦磷酸快速鑒定。本研究使用常見的7種致病菌：副溶血性弧菌、單核細胞增生李斯特菌、福氏志賀菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸0157進行實驗。發現使用V6區設計的引物（見1.2.1），對其中5種菌（副溶血性弧菌、單核細胞增生李斯特菌、福氏志賀菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌）擴增后均可以進行測序區分，省時省力。本研究以V6區設計的引物作為通用引物，建立焦磷酸測序對5種致病菌的快速鑒定方法。

3.1.2??? 方法證實??? 為進一步驗證方法的可靠性，本研究用上述5種標準菌株及實驗室樣品中分離的5種陽性菌株進行多次測定，測定結果與傳統培養法、全自動微生物鑒定儀鑒定結果進行比對，鑒定結果均一致。

3.2??? 同類研究比較

焦磷酸測序作為新一代DNA測序技術，在突變基因[11-13]、DNA甲基化[14-15]等方面已有大量研究報道。在致病菌的快速檢測方面，曹冬梅等[16]建立了快速鑒定食品中腸炎沙門菌的PCR—焦磷酸測序法，張麗娜等[10]建立了快速檢測3種海洋性弧菌的焦磷酸測序方法。對致病菌的快速鑒定，多采用不同引物，對不同致病菌鑒定，操作煩瑣。本研究建立的焦磷酸測序對5種致病菌的快速鑒定方法，僅采用一條通用引物，即可同時滿足對5種致病菌的快速鑒定，操作更方便，鑒定時間更短，可大大提高鑒定效率。

3.3??? 不足之處及今后探索的方向

因本研究實驗室菌株有限，該方法僅驗證了7種致病菌，測序后其中5種致病菌均能得到良好的測序結果。未能實現對更多致病菌的鑒定研究。今后將繼續探索研究，希望能夠建立焦磷酸測序對更多致病菌的通用鑒定方法，為實驗室快速鑒定致病菌提供更多的參考。

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