兩株芽孢桿菌對茶用菊紅心菊生長和品質的影響

羅孟婷 方馨妍 葛禮姣 管志勇 陳素梅 房偉民 陳發棣 趙 爽

(南京農業大學園藝學院/華東地區花卉生物學國家林業和草原局重點實驗室，江蘇 南京 210095)

菊花(Chrysanthemummorifolium)起源于我國，栽培歷史悠久，種植廣泛，具有較高的觀賞價值及經濟價值[1]。除觀賞栽培外，茶用菊因含有黃酮類化合物、揮發油成分、綠原酸等多種抑菌、抗氧化及抗腫瘤成分[2-3]，成為深受人們歡迎的健康保健飲品，市場需求日益增加。然而，隨著茶用菊栽培面積的不斷擴增以及種植年限的累積，茶用菊栽培土壤環境日益惡化，營養元素比例日漸失衡，根系有害分泌物連年積累導致茶用菊植株矮化、葉片腐爛、花型畸變等，嚴重影響茶用菊花生長及品質[4-5]，即便存活也不能作為商品出售。

植物根際中存在著數量龐大、種類繁多的微生物，其中植物根際促生細菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)能夠在根際定殖[6]，且具有促生[7]、協助植物抗逆[8-9]或生防[10-11]等功能，可以直接或間接地促進植物的生長和發育[12-14]。目前，已鑒定出的PGPR菌株包括芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、腸桿菌屬(Enterobacter)和黃單胞菌屬(Xanthomonas)等[15]。其中，芽孢桿菌屬菌株是一類重要的菌種資源，在生物肥料和生物農藥等領域受到廣泛關注[16]。楊曉云等[17]通過盆栽試驗研究表明，不同稀釋倍數的解淀粉芽孢桿菌上清液均對番茄生長具有顯著促生作用；張德珍等[18]通過發芽試驗和盆栽試驗研究，發現解淀粉芽孢桿菌可以促進種子萌發和幼苗生長；葉如夢等[19]通過在不同土壤條件下接種枯草芽孢桿菌，發現土壤條件雖然在一定程度上會限制枯草芽孢桿菌的促生能力，但無論貧瘠組還是營養組均能促進香蜂花的生長。此外，PGPR菌株不僅對環境具有較高的敏感性，而且與宿主之間存在特異性[20]。

茶用菊作為我國獨特的功能性菊花，相關研究以我國為主，國外鮮有茶用菊品種或栽種技術的報道。以往，我國有關茶用菊的研究多集中在品種選育[21]與花期、產量[22]等生產特性方面，而關于PGPR菌株在茶用菊綠色高效栽培中的研究鮮有報道。南京農業大學菊花實驗室從不同菊花根際土壤中篩選到兩株根際細菌，經鑒定分別為枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌，本研究擬通過大田試驗，進一步研究其對茶用菊的促生作用，以期為今后茶用菊優質綠色栽培提供理論依據及技術支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗地概況

試驗于2020年7月至11月在南京農業大學中國菊花種質資源保存中心進行。供試材料為茶用菊紅心菊，由南京農業大學中國菊花種質資源保存中心提供。試驗地土壤pH值5.15，可溶性鹽濃度值(the value of electrical conductivity, EC)100 μS·cm-1，銨態氮含量68.95 mg·kg-1，速效鉀含量97.90 mg·kg-1，速效磷含量59.55 mg·kg-1。

1.2 供試菌株分離與純化

從不同地域菊花栽培田采集菊花植株及根際土壤，參照趙佳淼[23]的方法分離菌株。分離獲得的2株菌株枯草芽孢桿菌(Bs)和解淀粉芽孢桿菌(Ba)在LB固體培養基上重復劃線純化菌株。參照《伯杰細菌鑒定手冊》[24]進行菌落外觀形態鑒定。挑取單菌落于LB液體培養基中過夜培養，搖床溫度為37℃，轉速為200 r·min-1，培養至OD600為1.0，提取菌株的總DNA用于16S rDNA基因PCR擴增。正向引物F357：5′-C C T A C G G G A G G C A G C A G-3′；反向引物R518：5′-A T T A C C G C G G C T G C T G G-3′。PCR反應體系(20 μL)：Taq PCR Master Mix(2×，with Blue Dye)10 μL，F357(10 μmol·L-1)1 μL，R518(10 μmol·L-1)1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸15 s，34個循環；72℃終延伸 5 min。擴增產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳，然后送至通用生物系統有限公司測序。將得到的16S rDNA基因序列在國家生物技術信息中心(national center for biotechnology information, NCBI)進行比對，并使用Mega-X構建菌株的遺傳系統發育樹。

1.3 菌株懸液制備及試驗方法

將-80℃甘油管保存的菌株Bs和Ba在LB固體培養基上劃線活化，37℃、200 r·min-1過夜培養，翌日吸取適量菌劑至新鮮LB液體培養基中擴大培養10～12 h，用血球計數板計數，4℃保存備用。

供試植株扦插苗在穴盤中培養，15 d后生根時，選擇健康、長勢一致的扦插苗移栽到大棚中。移栽時，采用灌根接種的方法處理植株，接種菌劑濃度約為1.0×108CFU·mL-1。試驗共設4個處理：以未接種的LB培養液為空白對照(CK)，根際接種Bs菌株處理組(Bs)，接種Ba處理組(Ba)，混合接種Ba和Bs處理組(Ba+Bs)，每個處理設50株重復，共計200株，常規栽培管理。每隔30 d對紅心菊進行外觀形態指標、根系指標、花期產量及品質指標等生理指標測定。外觀形態指標株高、莖粗、冠幅的測定方法參照文獻[22]；植株洗凈吸干水分后測定鮮重，于37℃烘箱中烘干至恒重后測定干重；根系指標通過STD 4800根系掃描儀(Epson，印度尼西亞)進行測量；花期采摘鮮花烘干后測定總黃酮、綠原酸、木犀草苷、3,5-二咖啡酰基奎寧酸含量，測定方法參照文獻[21]；估產量為50株試驗苗的總產量。

1.4 統計與分析

試驗數據用Excel 2010軟件進行數據初步統計與整理，采用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析和差異顯著性檢驗(Duncan法，P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 菌株形態及分子鑒定

菌株Ba和Bs在LB固體培養基上生長狀態良好。Ba菌落顏色呈淡黃色不透明，表面有隆起，邊緣不規則；Bs菌株菌落顏色呈黃色不透明，表面粗糙，邊緣不規則(圖1)。

圖1 菌株Ba和Bs在LB培養基正反面的生長狀態

為進一步確定菌株的種類，對兩株芽孢桿菌進行PCR擴增和測序，測序所得結果在NCBI進行序列比對，發現菌株Ba與Bacillusamyloliquefaciensstrain DGL1(CP065539.1：2923783-2923947)的相似性高達94%，菌株Bs與Bacillussubtilisstrain PCK054(MN913819.1：185-342)的相似性高達98.73%，結合菌體形態鑒定菌株Ba為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，菌株Bs為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)(圖2)。

圖2 16s rDNA基因序列菌株Ba和菌株Bs的系統發育樹

2.2 接種芽孢桿菌Ba和Bs對茶用菊紅心菊外觀形態指標的影響

由圖3可知，接種解淀粉芽孢桿菌(Ba)和枯草芽孢桿菌(Bs)后，紅心菊植株與CK相比在株高、冠幅、根系生長等方面表現出更好的長勢，且Ba+Bs處理的植株長勢優于Ba和Bs處理。

圖3 接種芽孢桿菌Ba、Bs和Ba+Bs對紅心菊生長的影響

接種芽孢桿菌處理對茶用菊紅心菊植株外觀指標有促進作用。由表1可知，苗期時，芽孢桿菌菌劑對茶用菊植株有不同程度的促進作用，Ba處理后植株株高最大，與CK相比增加了21.44%，Bs處理的植株莖粗最大，較CK增加22.99%，而Ba+Bs混合菌劑處理整體表現優于單一菌劑接種處理，與CK相比，植株冠幅、地上部鮮/干重、地下部鮮/干重分別增加25.23%、86.64%、161.72%、128.57%、80.00%。生長期時，Ba、Bs以及Ba+Bs處理組的植株株高、冠幅、地上部鮮/干重較CK均有顯著提高，只有Ba+Bs混合菌懸液處理對植株地下部鮮重提高作用顯著，較CK提高了28.44%。花期時，Ba、Bs和Ba+Bs菌懸液處理的植株株高和冠幅與CK相比有顯著性差異，株高較CK分別提高了19.66%、19.51%、21.75%，冠幅分別增長了23.92%、38.17%、51.74%，Ba+Bs處理組結果更優，同時發現僅Ba+Bs處理的植株地上部鮮重和干重與CK相比具有顯著性差異，分別增加53.89%和57.79%。

表1 接種Ba、Bs和Ba+Bs對紅心菊外觀指標的影響

2.3 接種芽孢桿菌Ba和Bs對紅心菊根系指標的影響

Ba、Bs和Ba+Bs處理對紅心菊根系指標表現出不同的促進作用(表2)。苗期時，分別接種Ba、Bs和Ba+Bs后，與CK相比，紅心菊植株總根長、總根表面積增加90%以上，根平均直徑增加27%～54%，總根體積增加130%以上，根尖數增加124%～206%，表現出較好的促進生長作用。生長期時，除根平均直徑外，Ba、Bs和Ba+Bs菌懸液處理后植株總根長、總根表面積、總根體積、根尖數與CK相比顯著增加，表明接種Ba、Bs和Ba+Bs菌懸液對紅心菊根系具有縱向促生長作用，其中Ba+Bs和Bs處理對植株總根長和總根表面積的促生長作用顯著高于Ba處理。與CK相比，Ba+Bs和Bs處理使總根長分別增加73.36%、60.78%，總根表面積分別增加73.36%、60.81%，Ba+Bs混合菌劑處理對總根體積的促生作用表現最優，增加46.62%，而Bs菌劑處理對根尖數的促生作用表現最優，增加1 012.89%。現蕾期時，Ba菌懸液處理后植株各項根系指標與CK相比均差異顯著，總根長、總根表面積、總根體積、根平均直徑和根尖數分別增加79.52%、74.35%、170.39%、78.76%和546.73%；Bs處理根系各項指標與CK相比無顯著差異；Ba+Bs處理對紅心菊總根長、總根表面積和根尖數影響最大，與CK相比分別增加96.33%、90.69%、1 339.23%。花期時，Ba和Ba+Bs菌懸液處理對紅心菊根平均直徑影響顯著，與CK相比，平均根直徑分別增加了52.47%和45.29%，表現出了較明顯的橫向促生作用。

表2 接種Ba、Bs和Ba+Bs對紅心菊根系指標的影響

2.4 接種芽孢桿菌Ba和Bs對紅心菊產量的影響

接種Ba、Bs和Ba + Bs混合菌懸液對紅心菊產量影響顯著(表3)。與CK相比，Ba、Bs和Ba+Bs處理后，紅心菊單花直徑分別增加了8.10%、7.70% 和5.51%；單花鮮/干重顯著增加，Bs菌劑處理后單花鮮重和單花干重分別達到了1.50和0.21 g，與CK相比分別增加了35.14% 和61.54%，而Ba和Ba+Bs處理后植株單花鮮重僅分別增加16.22%、18.92%。Ba、Bs和Ba+Bs菌懸液處理的紅心菊植株單株花數較CK分別增加31.07%、38.41%、111.29%，估產量分別增加53.54%、88.62%、152.00%，其中Ba+Bs處理后植株單株花數和估產量與其他處理表現出了顯著差異，說明該處理具有更好的可應用性。

表3 接種Ba、Bs和Ba+Bs對紅心菊產量的影響

2.5 接種芽孢桿菌Ba和Bs對紅心菊品質的影響

Ba、Bs和Ba + Bs混合菌懸液處理后紅心菊花朵中綠原酸、木犀草苷和3，5-二咖啡酰基奎寧酸含量與CK相比差異顯著(圖4)。2020版《中華人民共和國藥典》[25]規定，按菊花干燥品計算，綠原酸含量不得少于0.20%，木犀草苷含量不得少于0.08%，3,5-二咖啡酰基奎寧酸含量不得少于0.70%。經測定，CK紅心菊花朵中綠原酸含量僅為0.12%、木犀草苷含量為0.04%、3,5-二咖啡酰基奎寧酸含量為0.44%，均低于中國藥典標準。

圖4 接種Ba、Bs和Ba+Bs對紅心菊茶用品質的影響

CK紅心菊花朵中總黃酮含量為48.22 mg·g-1，而Ba+Bs處理后花朵中總黃酮含量為55.76 mg·g-1，提高了15.64%，在3個菌劑處理中增長率最高。Bs處理后花朵中綠原酸含量最高，較CK升高0.03個百分點；Ba處理后花朵中木犀草苷含量最高，較CK升高0.008個百分點；Ba、Bs以及Ba+Bs菌懸液處理的花朵中3,5-二咖啡酰基奎寧酸含量分別為0.55%、0.57%、0.56%，均未達到藥典標準，但與CK之間差異顯著，各處理3,5-二咖啡酰基奎寧酸含量分別增長0.10、0.12、0.11個百分點。以上結果表明，Ba、Bs和Ba+Bs可以提高茶用菊紅心菊茶用品質，提高幅度可達到20%以上，為改善茶用菊紅心菊品質提供了可能性。

3 討論

在根際微生物的促生研究中，菌株在實際應用中的效果是評價其促生作用的重要指標。本試驗結果表明，接種解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌對紅心菊均有促生效果。

解淀粉芽孢桿菌是一類重要的生防菌株，同時也是重要的植物根際促生菌株[26-29]。已有研究證實，解淀粉芽孢桿菌在番茄[17]、黃瓜[18]、草莓[30]、玉米[31]、水稻[32]等作物上都有顯著的促生作用，王華笑[31]發現解淀粉芽孢桿菌YM6可顯著提高玉米的生長指標和產量；徐瑛等[33]發現藜麥經過解淀粉芽孢桿菌處理后莖長、鮮干重顯著增加；李晴晴等[32]通過大田試驗發現經解淀粉芽孢桿菌FH-1處理后水稻的株高、穗長、單株穗數等均顯著提高。本研究結果表明，接種解淀粉芽孢桿菌Ba后，茶用菊紅心菊的株高、冠幅、莖粗、地上部鮮干重、地下部鮮干重等指標均有所提高，與前人研究結果一致，且Ba在苗期時對紅心菊促生效果最為顯著，表明根際促生菌可能是通過改善植株幼苗的營養吸收能力，進而提高植株各生長指標和花期產量。

枯草芽孢桿菌是中國農業部門批準的益生菌[34]，因為易于大量培養而被廣泛應用，已有研究表明其對苦瓜[35]、番茄[36]、花生[37]、馬鈴薯[38]、向日葵[38]等農作物均有促生作用，秦健等[35]發現根施8×105CFU·mL-1濃度的枯草芽孢桿菌可促進苦瓜莖粗、葉片數、葉綠素含量、全氮、全鉀、全磷含量顯著增加；劉秀梅[36]發現枯草芽孢桿菌可顯著提高番茄的株高和產量。本研究結果表明，單施枯草芽孢桿菌Bs后，紅心菊的生長指標均有所提高，接種Bs菌株濃度為108CFU·mL-1時，對紅心菊植株株高、莖粗、冠幅、地上部鮮/干重的促生作用顯著高于CK和Ba處理。Bs處理植株在苗期時促生作用最為顯著，說明通過苗期灌根接種的方式可以將枯草芽孢桿菌成功定殖到植株體內，促進幼苗根系生長速度，有利于植株充分的吸收水分和營養物質，同時提高苗期植株的抗逆性，保障植株良好的生長狀態，最終達到增產的目的[19]，楊倩倩[37]已在花生這一植株中證實枯草芽孢桿菌可以通過提高土壤中有益菌數量同時減少病原菌數量來改善植物根際生態環境，提高植株根系活力。

混合使用促生菌株可以更有效地激發土壤中有益微生物活性，實現多種促生菌功能互補、作用持久的協同促生效果[39]。Saini等[39]通過4種不同菌株的組合試驗發現，混合菌劑對于勛章菊的促生效果大于單一菌劑。本研究結果表明，Ba+Bs處理對紅心菊冠幅、地上部鮮干重指標促生作用表現最好，對紅心菊產量和茶用品質的影響也優于單施Ba和Bs，Ba+Bs處理后植株的估產量與CK相比，增長率達到了152.00%，花朵中總黃酮含量提高了15.64%，顯著高于Ba與Bs處理，與肖開興等[41]的研究結果一致，表現出了多菌株接種的促生優勢。此外Ba+Bs處理與Ba、Bs處理結果一樣，均為生長初期促生作用最顯著，菌劑處理后的紅心菊根尖數顯著增加，表明根際促生菌可通過促進側根的生長和根毛的形成來促進植物地上部生長，與在擬南芥和小葉錦雞兒上的研究結果一致[42-43]。隨著茶用菊紅心菊的生長發育，菌劑接種處理對植株地下部鮮干重、各項根系指標和根尖數的影響逐漸減小，進一步說明根際促生菌株主要通過影響幼苗初期根系的生長發揮作用，也可能與隨著處理時間的延長接種菌株的定殖量逐漸減少有關[44]。

一般來說，隨周圍環境因素的改變，植物體內會產生相應的化學物質，最終導致植物品質發生變化。孔留利等[45]研究表明接種菌株S61可促進毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花苷在黃芪根中的積累；撒多文等[46]研究表明接種根瘤菌之后苜蓿中可溶性蛋白含量增加；李昌寧等[47]研究發現分離出的假單胞菌屬、固氮菌屬、芽孢桿菌屬菌株能有效改善植株品質，猜測可能是由于根際促生菌株可以促進粗蛋白和粗脂肪的合成，同時抑制酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維合成，在顯著提高植株產量的同時，也能有效改善植株品質。2020版《中國藥典》[25]指出菊花頭狀花序中的綠原酸、木犀草苷、3,5-二咖啡酰基奎寧酸、總黃酮以及各種維生素、氨基酸等是衡量菊花質量標準所依據的重要指標，本研究結果表明，Ba、Bs和Ba+Bs處理后紅心菊花朵中的總黃酮、綠原酸、木犀草苷以及3,5-二咖啡酰基奎寧酸含量均有不同程度的增加，與CK相比，綠原酸、木犀草苷以及3,5-二咖啡酰基奎寧酸含量可提高20%以上，與前人研究結果一致，結合上述生長指標變化表明根際促生菌株可以通過一系列復雜的機制影響植物營養元素的積累，進而影響植株品質。

4 結論

本研究通過系統地開展茶用菊紅心菊全生育期的田間試驗，明確了兩株菊花根際土壤分離出的芽孢桿菌Ba與Bs對茶用菊紅心菊的促生作用。研究結果表明，在茶用菊苗期栽培土壤中混合接種解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌(Ba+Bs)可以顯著提高紅心菊的外觀品質、花期產量以及茶用品質，為今后充分利用根際微生物資源優勢奠定了先期基礎。植物根際促生細菌促生作用機制包括直接作用和間接作用，具有一種或多種促生特性，因其來源、寄主及環境的差異而促生機理不同，后續研究將進一步探究上述菌株在茶用菊根際的定殖特性，輔以代謝組學手段解析其對茶用菊促生的作用機制，以期為茶用菊綠色高效栽培提供理論依據。