肺脹2號方對COPD體外細胞模型分泌IL-8、MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1的影響

柯庚申，洪春霖，洪敏俐，黃錦榕，蘇寶連，陳慧暖

（福建中醫藥大學附屬漳州中醫院，福建 漳州 363000）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一種以進行性的、不完全可逆的氣流限制為特征的慢性氣道疾病，發病率高，且嚴重影響患者的生命質量［1］。肺脹2 號方是福建中醫藥大學附屬漳州中醫院洪敏俐主任所擬定的協定方，主要治療COPD 穩定期肺腎氣陰兩虛證，具有補肺滋腎、益氣養陰、納氣平喘之功。課題組前期研究顯示該方具有抗氧化、改善COPD 評估測試（CAT）評分及中醫證素積分、提高患者生活質量等效果［2-4］。本次研究通過香煙煙霧提取物（CSE）刺激人支氣管上皮細胞（16HBE）建立體外COPD 模型，探討肺脹2 號方對16HBE 分泌IL-8、MMP-9、TIMP-1 的影響，探討肺脹 2 號方治療COPD 的作用機制。

1 材 料

1.1 細胞株 16HBE（上海中喬新舟生物科技有限公司，貨號：ZQ0001）。

1.2 實驗藥品 肺脹2 號方（漳州片仔癀藥業有限公司，批號：201509001，規格：每片0.5 g，每片含生藥量1.476 g）；地塞米松磷酸鈉注射液（廣州白云山天心制藥股份有限公司，批號：2101191B6，規格：5 mg/mL）。

1.3 主要試劑及儀器 玉溪牌香煙［紅塔煙草（集團）有限責任公司］；0.25%Trypsin-EDTA（美國Ther?mo Fisher 公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、RPMI-1640細胞培養基、胎牛血清（FBS）、1%青霉素/鏈霉素均購自美國HyClone 公司；6 孔細胞培養板（無錫耐思生物科技有限公司）；細胞培養瓶（美國康寧公司）；微孔濾膜（德國默克Millpore有限公司，規格：0.22μm）；ELISA 試劑盒（上海酶聯生物技術有限公司）；生物安全柜（力康生物醫療科技控股有限公司）；CO2孵育箱及低溫離心機（美國Thermo Fisher 公司）；酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）。

2 方 法

2.1 肺脹2 號方溶液制備 參考本課題組前期研究的方法［5］：將肺脹2 號方藥片研成粉末，溶解于PBS液中，放入離心機，以1 000 rpm 速度離心3 min，棄去無法溶解的藥片殘渣，取上清液，加PBS 使肺脹2 號方溶液濃度為5 mg/mL（相當于生藥質量14.76 mg/mL），經微孔濾膜過濾后放置于-80℃冰箱凍存備用。

2.2 完全培養基制備 取RPMI-1640 細胞培養基500 mL，加入FBS 50 mL、1%青霉素/鏈霉素5.5 mL混合而成。

2.3 CSE 原液制備 參照 MARCH 等的方法［6］制備：用1 支去過濾嘴香煙，點燃后經負壓吸引裝置連續抽吸，吸入的煙霧導入25 mL 完全培養基中，密閉搖勻，用 5%NaHCO3調整 pH 至 7.4，經微孔濾膜過濾，得到的懸液即為100%CSE 原液。

2.4 16HBE 細胞傳代培養 將16HBE 細胞放置于完全培養基中，在37℃、5%CO2培養箱中靜置培養，每3 d 更換一次完全培養基。當細胞貼壁生長至80%左右的匯合度時，棄去培養液，加入0.25%Trypsin-EDTA 于培養箱中消化3 min 后，加入完全培養基終止消化，在1 000 rpm、4℃的離心機中離心3 min，棄上清液，加入適量完全培養基，并予加液槍反復輕柔吹打，制成16HBE 細胞懸液。

2.5 CSE 適合濃度篩選 將16HBE 細胞懸液以1×105/孔接入6 孔細胞培養板培養，每孔2.5 mL，當細胞貼壁生長至60%左右的匯合度時，吸掉舊的培養基，分別加入 2.5%、5%、10%、20%、50%CSE 2.5 mL，放入37℃、5%CO2培養箱中孵育 24 h，MTT法檢測細胞存活率篩選合適的煙霧造模濃度。由表 1 可知：2.5%CSE 刺激的 16HBE 細胞存活率為（81.33±2.02）%，是各濃度最高，故選取2.5%CSE為適合的造模濃度。

表1 不同濃度 CSE 干預后 16HBE 細胞存活率情況（）

表1 不同濃度 CSE 干預后 16HBE 細胞存活率情況（）

注：與空白組比較，1）P＜0.01。

細胞存活率/%94.33±0.88 81.33±2.021）32.67±1.201）12.33±1.451）4.00±0.581）1.33±0.331）CSE濃度0%2.5%5%10%20%50%

2.6 16HBE 分組培養 確定合適的煙霧造模濃度后，參照“2.4”步驟重新制成16HBE 細胞懸液，將16HBE 細胞懸液分為 6組，分別為空白組、CSE組、地塞米松組及肺脹2 號方低、中、高劑量組，每組設計 3 個復孔，每孔 2.5 mL，以1×105/孔接入 6 孔細胞培養板于37℃、5%CO2培養箱中孵育，當細胞貼壁生長至60%左右的匯合度時，吸掉舊的培養基后加入藥物干預。加藥方法：①空白組，加入完全培養基 2.5 mL；② CSE組，取 5 mL 100%CSE 加入完全培養基15 mL，稀釋成2.5%CSE，每孔加入2.5%CSE 2.5 mL；③地塞米松組，取5 μL 地塞米松磷酸鈉注射液加入25 mL 2.5%CSE中，得到終濃度為2.5%CSE、0.001 mg/mL 地塞米松磷酸鈉混合液，每孔加入混合液2.5mL；④ 肺脹2 號方低、中、高劑量組，采用倍比稀釋法，用完全培養基將100%CSE 及5 mg/mL肺脹2號方溶液分別稀釋成濃度為5%CSE 及0.125、0.25、0.5 mg/mL 肺脹 2 號方稀釋液，再將 5%CSE 分別和等體積的 0.125、0.25、0.5mg/mL 肺脹 2 號方稀釋液混合，即得到終濃度為2.5%CSE 和0.0625、0.125、0.25 mg/mL 肺脹 2 號方混合液，每孔分別加入上述混合液2.5 mL。加藥后繼續于CO2孵育箱中靜置培養24 h，收集上清液備用。

2.7 細胞形態觀察及細胞存活率檢測 各組收集上清液后，采用光學顯微鏡下觀察剩余貼壁細胞的細胞形態并拍照，再采用MTT 法檢測細胞存活率。

2.8 IL-8、MMP-9、TIMP-1 水平及 MMP-9/TIMP-1測定 采用雙抗體夾心ELISA 法檢測上清液中IL-8、MMP-9、TIMP-1 水平。

2.9 統計學方法 采用SPSS 22.0 軟件進行數據分析。計量資料屬正態分布以（）表示，2組比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析檢驗。

3 結 果

3.1 各組光鏡下細胞形態比較 見圖1。空白組細胞呈不規則多邊形，連接緊密；CSE組細胞部分形態變圓，間隙變大，細胞較稀疏，部分細胞皺縮成團，考慮細胞生長受抑制；地塞米松組與各劑量組細胞生長受抑制情況均較前改善，有較多細胞恢復到多邊形形態，細胞存活率明顯升高，特別是中劑量組，細胞形態與空白組差異不大。見圖1。

圖1 各組光鏡下細胞形態比較（×100）

3.2 各組細胞存活率比較 見表2。

表2 各組細胞存活率比較（）

表2 各組細胞存活率比較（）

注：與空白組比較，1）P＜0.01；與CSE組比較，2）P＜0.01；與地塞米松組比較，3）P＜0.05。

細胞存活率/%93.67±0.88 80.67±0.881）87.00±1.531）2）88.33±0.881）2）90.67±0.881）2）3）88.00±0.581）2）組別空 白組CSE組地塞米松組低劑量組中劑量組高劑量組

3.3 各組上清液IL-8、MMP-9、TIMP-1水平及MMP-9/TIMP-1 比較 見表3。

表3 各組上清液 IL-8、MMP-9、TIMP-1 水平及 MMP-9/TIMP-1 比較（）

表3 各組上清液 IL-8、MMP-9、TIMP-1 水平及 MMP-9/TIMP-1 比較（）

注：與空白組比較，1）P＜0.01；與CSE組比較，2）P＜0.01，3）P＜0.05。

MMP-9/TIMP-1 8.73±0.88 13.80±0.731）11.06±1.59 8.61±0.942）10.08±0.363）9.46±0.702）組別空 白組CSE組地塞米松組低劑量組中劑量組高劑量組IL-8/（pg/mL）161.04±5.66 248.65±18.891）191.19±26.633）181.56±19.993）168.10±6.902）182.85±8.753）MMP-9/（ng/mL）25.00±0.41 30.03±1.221）27.48±0.73 25.39±0.953）24.66±0.752）25.11±1.882）TIMP-1/（μg/L）2.92±0.27 2.18±0.04 2.56±0.28 3.00±0.25 2.45±0.07 2.68±0.27

4 討 論

吸煙是COPD 最重要的環境發病因素。相關研究［7］表明：CSE 中含有的數千種化學物質，除可直接對氣道上皮細胞和肺泡細胞產生損傷之外，還可激活多種信號通路，趨化大量炎癥因子釋放，引起蛋白酶和抗蛋白酶失衡，進而導致肺實質破壞、小氣道狹窄和氣道重構，最終造成持續氣流受限。氣道上皮細胞是呼吸道最先遭受外界有害物質刺激的地方，也是各種呼吸道疾病的病理基礎起始環節。因此，本研究采用煙霧刺激16HBE 細胞進行造模并進行后續相關研究。目前，國內外關于COPD 體外細胞模型的研究較少，宋雪慧等［8］采用2%～30%不同濃度的CSE 進行造模，最后結果顯示CSE 濃度大于12%時細胞存活率過低，適宜造模濃度為2%～12%左右，并將細胞存活率約為70%時的4%CSE 濃度作為造模適合濃度。侯紅平等［9］研究表明CSE 刺激肺泡上皮細胞的適合濃度為10%。本研究CSE 適合濃度篩選結果顯示：隨著CSE 濃度升高，其對16HBE 細胞的損害越大，5%以上CSE 刺激后細胞存活率太低，而2.5%CSE 刺激的16HBE 細胞存活率在80%以上，且原本連接緊密的細胞間隙變大，形態變圓，細胞較稀疏，說明煙草煙霧具有顯著的細胞毒性，因此，認為COPD 體外細胞模型造模成功。

慢性氣道炎癥貫穿COPD 發生、發展的全過程，各種各樣的細胞因子如促炎細胞因子、生長因子、趨化因子、淋巴因子等都是炎癥反應的參與者［10］。IL-8 是炎癥反應過程中的強效趨化因子，是引發、維持并加重氣道炎癥的一種重要的細胞因子［11］。它能夠趨化并激活炎癥細胞特別是中性粒細胞向炎癥部位聚集，抑制中性粒細胞降解，加強其吞噬作用及溶酶體酶活性，促使炎癥細胞釋放多種炎癥因子及蛋白酶，進而引發氣道、肺組織損傷等一系列病理改變［12］。氣道重構是COPD 發生、發展的另一重要機制，主要表現在肺實質的肺氣腫和小氣道阻塞，而呼吸道細胞外基質（ECM）的降解沉積失衡在氣道重構的過程中發揮了重要作用。MMP-9 及其天然抑制物TIMP-1 是調節ECM 穩定的主要酶類。正常組織MMP-9 表達很少，當受到刺激時，MMP-9 在多種肺實質細胞如支氣管上皮細胞、成纖維細胞、內皮細胞、平滑肌細胞等可廣泛表達，降解幾乎所有的ECM，并趨化炎性細胞，對肺組織產生嚴重的破壞［13］。TIMP-1 是 MMP-9 的天然抑制物，可特異性抑制MMP-9 的活性。兩者比例失衡，無論是升高或者降低均可導致細胞外基質合成和降解失衡，引起氣道重塑［14］。

肺脹2 號方具有補肺滋腎、益氣養陰、化痰祛瘀之功，前期研究已證實其在臨床應用中的良好療效［2-4］，本研究發現：CSE組上清液 IL-8、MMP-9 水平明顯升高，TIMP-1 水平降低，MMP-9/TIMP-1 較空白組明顯升高，表明16HBE 細胞群處于蛋白酶-抗蛋白酶失衡及炎癥反應狀態中，與COPD 的病理狀態類似。藥物干預后，地塞米松組及各劑量組均可有效改善16HBE 細胞形態，提高細胞存活率，降低IL-8水平；但同地塞米松組比較，各劑量組MMP-9 水平也得到有效降低，MMP-9/TIMP-1 降至接近空白組水平，提示各劑量組可以多途徑、更有效地改善COPD 體外細胞模型蛋白酶-抗蛋白酶失衡及炎癥反應的病理狀態。其中，中劑量組IL-8、MMP-9 水平最低，細胞形態及細胞存活率最佳，提示中劑量濃度可能是肺脹2 號方最適宜的治療濃度。

綜上，肺脹2 號方治療COPD 機制可能與下調IL-8 分泌、抑制MMP-9 過度表達、改善MMP-9/TIMP-1 平衡，從而降低COPD 慢性氣道炎癥，改善ECM 降解、沉積失衡，減輕氣道重構有關。