葉酸受體α監測循環腫瘤細胞診斷非小細胞肺癌的效能研究

劉天成 馬志紅 田萍 劉礦 劉紅松 臧金

肺癌是我國目前發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，其5年生存率不到15%[1]。有報道認為，肺癌的早期診斷、及時治療可使患者5年生存率提高到85%[2]。因此，探尋新的肺癌早期診斷方法或標志物對提高肺癌的治療效果及疾病轉歸具有重要的臨床意義。循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）是存在于外周血中各類腫瘤細胞的統稱，系自發或診療操作從實體瘤病灶脫落，進入外周血循環的腫瘤細胞或細胞簇。通過對CTCs的檢測可動態監測原發腫瘤灶癌細胞入血情況，能夠提高患者的早期診斷率，并對患者的治療效果及預后作出客觀評價。早期的研究表明，采用檢測上皮細胞黏附分子陽性CTCs（EpCAM+CTCs）的方法診斷非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），晚期 NSCLC 患者的陽性率僅為 50%[3]，究其原因，CTCs在發生上皮間質轉化時會發生上皮細胞表型丟失，從而造成EpCAM+CTCs的漏檢或假陰性。葉酸受體 α（folate receptor alpha，FRα）是一種與葉酸結合的糖基化磷脂酰肌醇錨定糖蛋白，在多種腫瘤的細胞膜上過度表達，而在大多數正常組織中表達水平極低[4-7]。因此，本研究以FRα為靶點，檢測NSCLC患者外周血中葉酸受體α陽性循環腫瘤細胞（FRα+CTCs）水平，探討其診斷NSCLC的效能。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2016年1月至2020年12月湖州市中心醫院收治的149例 NSCLC患者，其中男83例，女 66 例，年齡 45～74（63.2±8.3）歲；鱗癌 63 例，腺癌86例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期56例，Ⅲ～Ⅳ期93例。所有患者均確診為原發NSCLC，無其他上皮性腫瘤或傳染病病史，臨床資料完整，均未接受放化療。選擇本院同期肺部良性疾病患者60例為良性對照組，男35例，女 25 例，年齡 46～80（62.8±9.3）歲；其中肺結核 8 例，肺部炎性假瘤12例，支氣管擴張癥15例，慢性阻塞性肺疾病25例。選擇本院同期健康體檢者60名作為陰性對照組，男 37名，女 23名，年齡 40～71（60.8±9.6）歲。3組對象性別、年齡比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。本研究經本院醫學倫理委員會批準，所有患者簽署知情同意書。

1.2 方法 取3組對象清晨空腹靜脈血3 ml，使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，30 min內進行檢測，采用配體靶向聚合酶鏈式反應（ligand target PCR，LT-PCR）方法檢測FRα+CTCs水平。檢測步驟按照格諾思博生物科技有限公司提供的Cytolorare循環肺癌細胞試劑盒說明書操作，以FU/3 ml為FRα+CTCs單位。比較3組對象外周血中FRα+CTCs水平，分析NSCLC患者外周血中FRα+CTCs水平與性別、年齡、吸煙史（從不吸煙或平均吸煙少于1次/月定義為不吸煙）、腫瘤組織類型、分化程度、大小、淋巴結轉移、臨床分期等臨床特征的關系。

1.3 統計學處理 采用SPSS 23.0統計軟件。非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗，多組間比較采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗。采用ROC曲線評估FRα+CTCs水平鑒別診斷NSCLC組和良性對照組、NSCLC組和陰性對照組的效能，并計算靈敏度、特異度。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組對象外周血中 FRα+CTCs水平的比較NSCLC組外周血中FRα+CTCs水平為12.31（9.48，16.52）FU/3 ml，良性對照組為 6.23（4.90，8.30）FU/3 ml，陰性對照組為 5.50（4.54，7.82）FU/3 ml，NSCLC 組外周血中FRα+CTCs水平較良性對照組和陰性對照組明顯升高（Z=-7.021、-7.262，均 P＜0.01），而后兩者間比較差異無統計學意義（Z=-1.291，P＞0.05）。

2.2 NSCLC患者FRα+CTCs水平與臨床特征的關系FRα+CTCs水平與NSCLC患者臨床病理特征之間的關系見表1。結果發現，FRα+CTCs水平僅與NSCLC患者腫瘤臨床分期有關（P＜0.05），與性別、年齡、吸煙史、腫瘤組織類型、分化程度、大小、淋巴結轉移均無關（均 P＞0.05）。

表1 NSCLC患者FRα+CTCs水平與臨床病理特征的關系（FU/3ml）

2.3 FRα+CTCs水平用于診斷NSCLC的效能 ROC曲線分析表明，FRα+CTCs水平是NSCLC的潛在腫瘤標志物。FRα+CTCs用于鑒別診斷NSCLC組和良性對照組、NSCLC組和陰性對照組的AUC值分別為0.811（95%CI：0.746～0.875）和 0.820（95%CI：0.758～0.885）。此外，取Youden指數最大值，最佳截斷值為9.370FU/3 ml，FRα+CTCs診斷NSCLC組和良性對照組的靈敏度為0.758，特異度為0.917；最佳截斷值為9.495 FU/3 ml，FRα+CTCs診斷NSCLC組和陰性對照組的靈敏度為0.752，特異度為0.917。見圖1。

圖1 FRα+CTCs用于診斷NSCLC效能的ROC曲線

3 討論

FRα是糖基化磷脂酰肌醇錨定糖蛋白，在多種癌癥中高表達，如頭、頸部腫瘤[4]，乳腺癌和卵巢癌[5]以及NSCLC[6]。有研究表明，72%～83%的肺腺癌患者在細胞膜上過度表達FRα，但在正常成人組織中表達有限[7]。因此，采用檢測外周血FRα+CTCs可有效避免EpCAMCTCs的丟失，提高診斷有效率。

本研究發現，NSCLC組外周血FRα+CTCs水平高于良性對照組和陰性對照組（均P＜0.01），而后兩者間比較差異無統計學意義（P＞0.05），這表明外周血FRα+CTCs水平可能是監測肺部疾病惡化的潛在腫瘤標志物。進一步分析NSCLC患者FRα+CTCs水平與臨床病理特征之間的關系，發現FRα+CTCs水平與NSCLC患者的性別、年齡、吸煙史、腫瘤組織類型、分化程度、大小、淋巴結轉移均無關（均P＞0.05），但與NSCLC的臨床分期有關（P＜0.05）。Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者FRα+CTCs水平顯著高于Ⅰ～Ⅱ期NSCLC患者，該結果提示，隨著NSCLC病程的進展，外周血中更易檢測到FRα+CTCs，此結果與Chen等[8]報道類似。筆者認為，這可能與腫瘤細胞的侵襲性有關，在腫瘤進展的中晚期，有更多的侵襲性、轉移性強的CTCs播散到血液中，從而檢測水平更高。

由于缺乏特異性的CTCs檢測標志物，目前常用檢測主要基于腫瘤細胞表面EpCAM的表達來分離CTCs，并對其進行計數。然而這一方法可能明顯低估了CTCs的數量。尹寒露等[9]采用陰性-磁性法分離和富集CTCs，經EpCAM免疫熒光染色后，流式細胞儀鑒定CTCs并計數，結果顯示47例患者的血液樣品中，EpCAM+CTCs的檢出率僅為48.9%[8]。本研究中，ROC曲線分析表明，FRα+CTCs診斷NSCLC組和良性對照患者的最佳截斷值為9.370 FU/3 ml，AUC值為0.811（95%CI：0.746～0.875），靈敏度為 0.758，特異度為0.917；FRα+CTCs鑒別診斷NSCLC組和陰性對照的最佳截斷值為 9.495 FU/3 ml，AUC 值為 0.820（95%CI：0.758～0.885），靈敏度為 0.752，特異度為 0.917。該結果提示，采用檢測FRα+CTCs水平可有效提高NSCLC的診斷率，是其潛在有效的診斷標志物。

綜上所述，檢測外周血FRα+CTCs水平是一種簡單、無創可用于NSCLC鑒別診斷的方法，但由于本研究的樣本量較小，應進一步招募更多的NSCLC患者樣本以證實本研究結果，如能采用聯合EpCAM+CTCs和FRα+CTCs水平檢測，將會為NSCLC非侵入性診斷提供更多重要的信息。