環境內分泌干擾物對子宮內膜異位癥影響的生物信息學分析

李楠 陳蕾 張琨

環境內分泌干擾物（environmental endocrine disrupting chemicals，EDCs）包括雙酚類、鄰苯二甲酸酯類、二惡英類等，廣泛應用于洗滌劑、增塑劑、阻燃劑等生產中。大部分EDCs具有半衰期長和生物富集等特點，在體內改變DNA甲基化水平，并長期影響生殖和類固醇激素相關基因的表達水平，進而影響女性性腺發育的激素依賴途徑。而作為雌激素依賴性的子宮內膜異位癥（endometriosis，EMS）發病率呈逐年增加趨勢，持久影響女性生育能力及生活質量。已知EMS發病受遺傳、氧化應激、免疫、環境等多種因素影響，且大量研究提示EDCs可能在病因學上參與EMS的發生。但EDCs種類繁多，作用機制復雜，人類EMS和EDCs暴露之間因果關系的直接研究證據很難獲得，導致EDCs對EMS發生的潛在機制仍無定論。隨著生物信息學的發展，遺傳多態性研究備受關注。筆者采用生物信息學分析挖掘EDCs暴露在EMS發生中的潛在作用靶點及相關通路，旨在尋找EDCs暴露對EMS的潛在影響，為繼續探究復雜環境中EMS的病因、致病機制乃至防治提供參考。

1 資料和方法

1.1 基因篩選 在毒物基因組學數據庫（comparative toxicogenomics database，CTD）（http://ctdbase.org/）中檢索雙酚A（bisphenol A，BPA）、四氯二苯并對二惡英（tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）、鄰苯二甲酸二酯[di-（2-ethylhcxyl）phthalate，DEHP]，在疾病欄找到Endometriosis，確定在EMS發生中與各EDCs暴露相關的基因。

1.2 確定共同作用基因 在Venn圖網絡工具（bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）中輸入CTD數據庫檢索到的上述3種EDCs在EMS中的調控基因，進而確定3者調控的公共基因。

1.3 基因生物信息學分析 將上述共同作用基因輸入富集分析數據庫（the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID）（https://david.ncifcrf.gov/），對其進行基因功能注釋（gene onotology,GO）分析[錯誤發現率（FDR）值＜0.01為差異有統計學意義]和京都基因與基因百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析（FDR 值＜0.05為差異有統計學意義）。

1.4 基因蛋白互作網絡（protein-protein interaction networks，PPI）構建 將共同作用基因上傳到STRING數據庫（http://string-db.org/）進行 PPI建設，并用 Cytoscape3.8.0 軟件（www.cytoscape.org/）將 PPI網絡可視化，并利用插件Analyze Network計算連接度最高的6個基因作為關鍵基因。

2 結果

2.1 確定共同作用基因 在CTD數據庫檢索到BPA與EMS相關的基因158個，TCDD與EMS相關的基因155個，DEPH與EMS相關的基因 25個，3者調控EMS的公共基因共25個，見圖1。

圖1 環境內分泌干擾物作用的公共基因

2.2 EDCs公共作用基因的GO分析 上述25個基因中包含一個非人類基因，對剩下24個基因進行GO分析，這些公共作用基因主要富集于對遺傳信息的調控，以及受體和信號的轉導等功能，見圖2。

圖2 環境內分泌干擾物公共作用基因的功能注釋分析

2.3 EDCs公共作用基因的KEGG分析 對24個公共基因的作用途徑進行KEGG分析，這些公共作用基因主要富集于甲狀腺激素信號通路、催乳素信號通路、卵巢類固醇合成、MAPK信號通路和雌激素信號通路。結果提示，EDCs確實發揮了內分泌干擾作用，干擾機體內分泌相關信號通路，見圖3。

圖3 環境內分泌干擾物公共作用基因的富集通路分析

2.4 EDCs公共作用基因的PPI分析 最后篩選出原癌基因（fos proto-oncogene,FOS）、糖皮質激素受體（nuclear receptor subfamily 3 group C member 1，NR3C1）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、雌激素受體 β（estrogen receptor beta，ESR2）、類固醇受體共激活劑（nuclear receptor coactivator 1，NCOA1）、前列腺素內過氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2）6 種在該網絡中連接度最強的基因。

3 討論

EMS是女性月經來潮后所發生的一種子宮內膜異位到其他部位的疾病。有研究發現，一些成人疾病可能起源于胎兒，即母體壓力、污染物暴露等因素會影響胎兒基因編碼，導致胎兒器官結構、新陳代謝和表觀遺傳等發生改變，增加患病風險[1]。EMS是一種雌激素依賴性疾病，雌激素對靶細胞的活性可能通過雌激素受體來實現。FOS被認為是雌激素早期反應的關鍵基因。一項研究發現，FOS基因在EMS中顯著差異表達[2]，其一方面可通過調控基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達參與17β-雌二醇促進的人子宮內膜基質細胞侵襲，另一方面也可能通過誘導雌激素發揮作用，參與EMS的發生、發展。通過對狒狒EMS模型疾病進展中異位子宮內膜的基因表達變化分析發現，FOS是在對照組和6～7個月疾病模型之間存在差異調節的單個基因，且其參與的EGF信號通路和ERK/MAPK信號通路被顯著調節[3]。NR3C1基因編碼糖皮質激素受體，參與炎癥性疾病的病理生理學。已經有研究發現EMS患者血清中皮質醇水平降低，甚至會影響EMS患者受孕[4]。但其在EMS發展過程中的具體作用還不清楚。EGFR編碼表皮生長因子受體，在EMS患者的異位病灶、血液、腹腔液中水平明顯增高，促進EMS侵襲，轉移過程中的血管生成。未來靶向VEGF基因治療EMS將會是重要方向。ESR2基因編碼ERβ，ERβ是EMS癥患者的主要雌激素受體。多項研究均已證實ESR2基因多態性會增加患EMS的風險[5]，且異位子宮內膜組織ESR2基因表達水平則明顯高于正常子宮內膜，ESR2 mRNA水平表達與其甲基化程度相關[6-7]。NCOA1是一種類固醇受體共激活劑，在人類和小鼠異位內膜病變中有選擇性地高水平表達，在子宮生物學和病理生物學中起著關鍵作用，沒有NCOA1小鼠子宮內膜無法表現出完整的蛻膜反應。有研究提示，TNF-α-MMP-9-NCOA1異構體信號軸通過阻止TNF-α介導的人類EMS細胞的凋亡來促進EMS的發病進展[8]。有研究提示NCOA1是雌激素的主要輔激活子后，調控異位內膜基質細胞表達基質細胞衍生因子1[9]。而基質細胞衍生因子1是內皮細胞、淋巴細胞和造血祖細胞的增殖和趨化因子，在組織修復、血管生成、侵襲和遷移中發揮重要作用。PTGS2編碼前列腺素內過氧化物合酶2，又名環氧合酶2，在各種細胞中可以被炎癥因子，有絲分裂原及生長因子誘導，參與炎癥反應，細胞增殖和凋亡。在EMS患者異位病灶和腹腔液中，PTGS2水平異常升高[10]，且PTGS2抑制劑可以促進EMS子宮內膜細胞凋亡[11]，提示PTGS2將來有望成為EMS的治療靶點。

總之，上述分析可以預測EDCs在EMS中的作用機制與其內分泌干擾性質相關，能夠作用于一些基因干擾內分泌信號通路，影響類固醇激素信號轉導，可能在EMS發生、發展中起重要作用。EMS是女性生殖系統良性疾病，可能會惡變為卵巢透明細胞癌和子宮內膜癌，如何早期診斷EMS并提前干預、改善預后仍然是臨床難題。近年針對基因水平改變的研究逐漸增多,在婦科腫瘤進展中表觀遺傳學機制已成為一個重要影響因素。隨著檢測技術的進步，一些表觀遺傳現象如DNA甲基化、微小RNA的表達和基因沉默、染色質重塑等改變在EMS中被鑒定出來,有望成為EMS新的預測生物標志物和治療靶點。而通過進一步挖掘環境-基因作用對EMS發病的影響及未來對EMS表觀遺傳學研究的深入，可能會找到新的靶點并為EMS的預防及早期診斷和靶向治療提供新的思路。