金花葵花中藥用成分分析

王瑞君，田 雨，吳佳文，王延峰，賈澤漢，白朕卿*，張秀娟

1延安大學 生命科學學院，延安 716000；2內蒙古科學技術研究院，呼和浩特 010018

金花葵(HibiseumanihotL.)為一年生草本錦葵科秋葵屬植物，以花入藥，藥食同源且具有保健功能[1]。其主要功效為清熱、涼血、解毒，清利濕熱、解熱抗炎、鎮痛、抗疲勞、抗衰老、降血脂、抑制腫瘤細胞、增強免疫力、抗氧化等，此外還能夠助消化，理氣，潤腸，美白，滋陰壯陽[2-5]。金花葵野生于北方山區，地域性獨特，被生物界譽為“植物大熊貓”和“生命救心草”[6,7]。由于對其資源缺乏保護，金花葵被認為已滅絕。但是2003年8月在河北省邢臺市發現了被認為已滅絕的金花葵資源，并且對其進行了保育，目前已經被廣泛種植[8]。

金花葵的成分包括天然黃酮類化合物、不飽和脂肪酸、維生素E、維生素C、蛋白質、高聚糖膠、植物纖維、性激素及多種微量元素等[9]。其中黃酮類化合物是金花葵的主要生物活性物質，且含量超出目前黃酮生產常用原料銀杏、大豆等數十倍[10]，是現在已知的植物中黃酮類含量最高的[11]。金花葵花總黃酮具有顯著抑菌效果，且可以抑制酪氨酸酶活性影響黑色素細胞的生物合成進而起到美白功效，在醫美方面有潛在的應用價值[12]。金絲桃苷為金花葵花中黃酮的主要成分[13]。金絲桃苷可以通過阻止鈣離子進入神經細胞內起到鎮痛作用，且人體對其沒有依賴性[14]。金花葵花中的性激素含量也比補腎類植物高很多，其豐富的天然植物雌激素，對于延長女性青春期，減輕中老年更年期綜合征也有奇效[15]。

目前對金花葵花的主要成分已經得到初步的分析，但有關不同花期藥用價值的評價還未見報道。近些年，超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜(UPLC-QTOF-MS)作為一種快速而有效的多成分分析技術，具有靈敏度高、分離能力強、檢測范圍廣等特點，已被廣泛應用于中藥的化學成分分析[16,17]。因此本研究通過超高效液相-串聯四級桿飛行時間質譜對三組金花葵樣品進行分析，鑒定金花葵鮮花、干花和花苞的成分，為闡明金花葵花期前后化學成分的變化規律以及為金花葵藥用物質基礎提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

金花葵為同一時期種植于內蒙古呼和浩特賽罕區生物技術研究所金花葵種植基地，開花期采集鮮花和花苞，將鮮花晾干制成干花，分別取干花、鮮花和花苞各6個樣本用于后續實驗測定。

1.2 UPLC-QTOF-MS方法

1.2.1 樣品制備

金花葵干花經粉碎機粉碎后過100目篩；花苞、鮮花分別加液氮研磨成粉末，將三種處理好的樣品分別精密稱定0.1 g，置5 mL離心管中，加甲醇(色譜純)3 mL，稱量，超聲(功率300 W，頻率60 kHz)提取45 min，放置至室溫，再稱量，用甲醇(色譜純)補足損失的量，濾過，取續濾液0.22 μm微孔濾膜濾過，即得三種待測樣。質控樣品由金花葵鮮花、干花和花苞提取溶液等體積混合得到。

1.2.2 色譜條件

采用ACQUITY UPLCTMI-Class和XevoG2XS QTOF聯用；色譜柱為Waters BEH T3 1.8 m(2.1 mm×150 mm)；柱溫40 ℃；梯度洗脫溶劑A為水溶液(含0.1%甲酸，甲酸為色譜純)；B為乙腈(色譜純)；梯度洗脫過程如下：97%A(0～1 min)、94%A(1～2 min)、88%A(2～2.5 min)、75%A(2.5～11 min)、50%A(11～13 min)、0%A(13～15 min)、0%A(15～17 min)、97%A(17～20 min)；流速為0.4 mL/min；進樣量為10 μL。

1.2.3 質譜條件

電噴霧電離(ESI)離子源；采集質量范圍為50-1 200 Da；離子化模式為ESI(+/-)采集MSE；毛細管電壓為1.0 kV；離子源溫度為100 ℃；霧化器溫度為450 ℃；霧化器流速為800 L/h；錐孔電壓為40 V；碰撞能量是低能4 V/高能15～60 V；數據處理軟件為UNIFI 1.9.2。

1.2.4 數據定性與定量分析

采用UNIFI對差異物質進行定性分析；每張TOF MS一級譜圖跟隨10張二級全碎片掃描開啟動態背景扣除DBS。利用超高100張/s的掃描速度，每個樣品峰都采集18個數據點，保證了數據質量。在保證掃描點數的同時，一級、二級圖譜都保證了30 000以上的高分辨率。利用m/z結合峰面積對物質進行定量分析。

1.3 數據處理與分析

采用AB SCIEX公司建立的天然產物質譜庫掃描，直接調用在線Chemspider數據庫檢索鑒定化合物。UNIFI對數據進行PCA、PLSDA、OPLSDA分析，得到的標志物可以直接鏈接到UNIFI進行未知物定性分析。差異化合物分析使用Markerview軟件處理后得到邊緣性即差異大的離子，可以加入到Interest List，導入到Peakview中的Masterview進行峰提取，選擇載荷圖中邊緣化的離子，t檢驗結果中P值小于0.05的離子。

2 結果與分析

2.1 金花葵干花、花苞和鮮花UPLC-Q-TOF-MS基峰強度離子分析

金花葵干花、花苞和鮮花樣品在正離子和負離子模式下的UPLC-Q-TOF-MS基峰強度離子流圖(BPI)示于圖1，正負離子流數據分析，共識別了24個色譜峰，通過質譜裂解碎片分析并結合文獻報道數據對照，正負離子兩種模式下共鑒定出141種化合物。

圖1 金花葵干花、花苞與鮮花提取液UPLC-Q-TOF-MS檢測的負離子模式和正離子模式總離子流圖

2.2 化合物鑒定

采用數據庫檢索流程和全未知物鑒定兩種流程，對花中成分進行鑒定，正負離子兩種模式下共鑒定出141種化合物。包括58個黃酮類化合物(正離子模式下推測出有牡荊素葡萄糖苷、槲皮素、紅景天苷；負離子模式下所得蘆丁、金絲桃苷、異槲皮素、槲皮素-3′-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、二氫櫻黃素、二氫櫻黃素-OCH2-葡萄糖苷、桑黃素-3-O-龍膽二糖苷、桑黃素、桑色素-葡萄糖鼠李糖苷、桑黃素-葡萄糖阿拉伯糖苷、楊梅素、楊梅素-葡萄糖苷、草夾竹桃苷等)，在負離子模式下共鑒定出27個有機酸類化合物(咖啡酸、檸檬酸、羥基檸檬酸、奎寧酸、香草酸等)，19個氨基酸類(在正離子模式下精氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、酪胺、負離子模式下有組氨酸、色氨酸等)內源性化合物，此外，還含有11個脂類化合物、9個核苷類化合物、3個亞油酸等不飽和脂肪酸和一些糖類、五環三萜、環烯醚萜類等其他類別化合物，詳細質譜數據列表見表1。

表1 詳細化合物質譜數據列表

2.3 金花葵干花、花苞與鮮花的PCA分析

金花葵干花、花苞與鮮花樣品在正離子和負離子模式下的UPLC-Q-TOF-MS數據PCA分析(見圖2)。每個點代表一個樣品，橫、縱坐標分別為第一、第二主成分得分。結果顯示無論是正離子模式還是負離子模式，干花和鮮花與花苞樣品在第一主成分得分上有明顯差異，即分別聚向橫軸的相反方向；干花、花苞、鮮花在第二主成分得分上有明顯差異，即分別聚向縱軸的相反方向；表明干花、鮮花、花苞三者UPLC-Q-TOF-MS數據的差異特征明顯。

圖2 金花葵干花、花苞與鮮花提取液UPLC-Q-TOF-MS的PCA得分圖

2.4 金花葵花差異物質分析

差異化合物評判：一是負離子載荷圖中邊緣化的離子，負離子載荷圖見圖3；二是t-檢驗結果中P<0.05的離子。使用Markerview軟件處理后得到邊緣性即差異大的離子，可以加入到Interest List，導入到Peakview中的Masterview進行峰提取。金花葵花差異物質是判斷其藥用價值的關鍵。本研究分別對金花葵干花、花苞、鮮花的差異物質進行了比較分析。結果顯示金花葵干花、花苞、鮮花中槲皮素-3-O-β-D葡萄糖醛酸、天師酸、蔗糖、木槿苷、槲皮萬壽菊素、2,3-(S)-Hexahydroxydiphenoyl-D-glucose、木犀草素-7-O-葡萄醛酸糖苷、槲皮素-3-O-(6′′-O-乙酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷、異金絲桃苷這九個成分有顯著差異(見圖4)。

圖3 干花、花苞與鮮花的負離子載荷圖

3 討論與結論

金花葵全株富含黃酮類物質，可作為植物提取行業生產黃酮的工業原料，具有很大的開發與利用市場[18]。金花葵花、根、果皮、莖、種子5個部位中花的總黃酮含量顯著高于其他部位[19]。金絲桃苷為金花葵花中黃酮的主要成分[20]，前人研究顯示金花葵不同部位金絲桃苷含量分布為：花>葉>莖>根>籽[21]。金絲桃苷成分主要分布在其花中，在金花葵花的3個階段(花蕾、鮮花、落花)中，金絲桃苷的含量高低依次為：花蕾>落花>鮮花，落花的含量為鮮花的1倍左右[22]。金花葵花中金絲桃苷，異槲皮苷在末期花中的含量約為初期花中的兩倍[23]。此外，金花葵干花總黃酮含量居于首位[24]。本研究結果顯示花苞內源性物質(如異亮氨酸、酪胺、N-甲基-a-氨基異丁酸)含量較鮮花和干花中高，而部分黃酮類化合物(如槲皮素-3-O-β-D葡萄糖醛酸、槲皮素-3-O-(6′′-O-乙酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷、木犀草素-7-O-葡萄醛酸糖苷、紅景天苷、山奈酚-葡萄糖阿拉伯糖苷、異金絲桃苷、木槿苷、槲皮萬壽菊素等)較鮮花和干花中低(見圖4)。鮮花中部分黃酮類(如楊梅素、草夾竹桃苷，異槲皮素、牡荊素葡萄糖苷、紅景天苷)和有機酸類化合物(香素酸、檸檬酸、羥基檸檬酸)，含量較干花和花苞中高。干花中部分黃酮類化合物含量(如桑色素、槲皮素、楊梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷、桑黃素、楊梅素-葡萄糖鼠李糖苷、二氫櫻黃素、羥基-甲基-楊梅素-葡萄糖苷)較鮮花和花苞中高。現有報道認為黃酮類化合物是金花葵的主要藥效成分[25]，由化合物差異分析結果可知，鮮花和干花較花苞的藥效成分多且含量高，如槲皮素-3-O-β-D葡萄糖醛酸、木槿苷、槲皮萬壽菊素、2,3-(S)-六羥基二苯酚-D-葡萄糖、木犀草素-7-O-葡萄醛酸糖、槲皮素-3-O-(6′′-O-乙酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷、異金絲桃苷等。

圖4 金花葵干花、花苞與鮮花中主要藥用活性成分分析

本研究建立了金花葵花的UPLC-Q-TOF-MS/MS快速分析方法，并鑒定了不同形式金花葵花內的主要有效成分。采用數據庫檢索流程和全未知物鑒定兩種流程，對花中成分進行鑒定，正負離子兩種模式下共鑒定出141種化合物，包括58個黃酮類化合物，27個有機酸類化合物，19個氨基酸類等內源性化合物，11個脂類化合物，9個核苷類化合物，3個亞油酸等不飽和脂肪酸和一些糖類、五環三萜、環烯醚萜類等其他類別化合物。此外，鮮花中與其他樣品中有顯著性差異的化合物為部分黃酮類和有機酸類化合物，含量較干花和花苞中高。干花中與其他樣品中有顯著性差異的化合物為部分黃酮類化合物，含量較鮮花和花苞中高。花苞中與其他樣品中有顯著性差異的化合物為內源性物質和部分黃酮類化合物，內源性物質含量較鮮花和干花中高，而部分黃酮類化合物較鮮花和干花中低。參考已報道的文獻，認為黃酮類化合物是金花葵的主要藥效成分，由化合物差異分析結果可知，鮮花和干花較花苞的藥效成分多且含量高，具體與藥效學結果是否一致，需進一步研究。

金花葵近年來受到廣大學者的青睞，其藥用活性成分的測定成為研究的熱點[26]。金花葵具有較強的適應能力，我國南北地區都可種植[27]，其花朵不僅具有藥用價值還可以制成花茶，也可研磨加工成粉，添加到粥或食品中[28,29]。黃酮類化合物在金花葵中的存在已有研究，但在花中卻鮮有公布，本研究初步比對了三種不同類型金花葵花中的有機化合物，其成分多樣，后期會充分對這些化學成分進行分離，鑒定和藥理活性的研究，更進一步闡述金花葵干花，鮮花和花苞的藥用價值。我們對金花葵花的主要活性成分含量進行研究，分析了金花葵花不同時期化學成分含量的差異，為金花葵不同花期入藥研究奠定了基礎，同時對闡明金花葵中物質基礎提供了有力參考依據，有助于金花葵后期功能產品的開發及臨床研究的應用。