吲哚菁綠造影在穿支皮瓣術后血管危象監測中的實驗研究

完顏超杰 吳中明 張峰瑞 李歡 楊子檜 王珺 韓雪嬌 楊向明 雷德林 楊新杰 魏建華

游離皮瓣移植是創面缺損修復的重要手段，在口腔頜面外科應用日益廣泛。近年來，穿支皮瓣因其設計靈活，微創美觀，最大程度恢復功能等優點，顯著提高了缺損修復的治療效果［1］。隨著顯微外科發展，皮瓣移植成功率已高達95%，但血管危象發生率仍接近10%～30%［2］。血管危象是游離皮瓣失敗的主要原因，如在8～12 h內不能及時發現和搶救，皮瓣將出現不可逆壞死［3］。穿支皮瓣血管比常規主力皮瓣血管口徑更為細小，術后更易發生動靜脈危象［4］。早期皮瓣危象的搶救成功率很高，因此有效監測及早發現和診斷血管危象尤為重要［4］。目前臨床上主要通過觀察皮瓣顏色、溫度、毛細血管充盈試驗、針刺試驗等方法診斷血管危象，但缺乏客觀統一標準，對觀察者有較高要求［5］。因此亟需一種客觀、即時、無創而簡便實用的方法進行術后監測［6］。吲哚菁綠造影（indocyanine green angiography，ICGA）不僅能在術中評估皮瓣血流灌注情況，而且術后有助于發現動靜脈危象［7］。本研究擬構建大鼠髂腰穿支皮瓣危象模型，探討ICGA識別皮瓣術后血管危象的規律，為臨床皮瓣監測提供指導。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年健康雄性SD大鼠（第四軍醫大學動物實驗中心）42只，體重（300±10）g。實驗操作符合第四軍醫大學動物實驗倫理要求。

1.2 主要試劑與設備

注射用吲哚菁綠（indocyanine green，ICG）（25 mg／支，丹東醫創藥業有限責任公司）；手術熒光影像系統Real-IGSFLI-10B系列（南京諾源醫療器械有限公司）；SXF-IC手術顯微鏡（上海醫光儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 髂腰穿支皮瓣制備 SD大鼠由1%戊巴比妥鈉（0.4 mL／100 g）經腹腔注射麻醉，右側背部脫毛，俯臥位，固定于手術臺。將FLI-10B的探頭移動對焦至髂腰穿支區，股靜脈給予0.05 mL濃度為2.5mg／mL ICG溶液，注射的同時開始FLI-10B探測并錄像。顯影過程中，將顯影最早、最亮、搏動最強的點定義為動脈穿支血管所在的位置。標記出髂腰穿支點，設計大小為5 cm×4 cm的髂腰穿支皮瓣。待ICG代謝消失熒光強度恢復基線水平后，自皮瓣遠端全層切開至淺筋膜，自淺筋膜深面向皮瓣近端剝離，顯露并剝離髂腰血管。離斷周圍所有組織，僅保留髂腰穿支血管（圖1）。

圖1 髂腰穿支皮瓣的制備Fig 1 Preparation of iliolumbar perforator flap

1.3.2 血管危象模型建立與分組 前期實驗表明動脈危象時長不同，ICGA圖像表現一致；靜脈危象時長不同，ICGA圖像表現各不相同；靜脈危象超過4 h，皮瓣熒光顯像不再變化。根據預實驗結果將實驗分為以下7組。對照組：保髂腰穿支血管，不作任何處理；動脈危象組（危象時長15 min）：8倍顯微鏡下分離髂腰動靜脈，結扎髂腰動脈，保留靜脈通暢；靜脈危象組：結扎髂腰靜脈，保留動脈通暢；根據危象時長分為5組，依次為15min，0.5、1、2、4 h（n＝6）。將皮瓣原位間斷縫合，動態觀測皮瓣變化。

1.3.3 皮瓣大體觀察和術后ICGA檢測 血管危象模型建立成功后，記錄各組皮瓣大體變化。再次行ICGA，注射后在第30、60、90、180、300 s抓拍圖像并定量分析熒光信號。以髂腰穿支點為中心選取1 cm×1 cm的感興趣區域（regions of interest，ROI），在周圍組織選取等大的ROI，Image J軟件計算出ROI的平均熒光強度值（mean fluorescence intensity，MFI），分別代表皮瓣和周圍組織的血流灌注量；線圖分析每組皮瓣和周圍組織MFI隨時間的動態變化；SPSS軟件計算注射后30 s皮瓣的相對灌注值（relative perfusion value，RPV），RPV＝MFI（皮瓣 ROI）／MFI（周圍組織 ROI）。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 皮瓣大體觀察

對照組皮瓣顏色紅潤，組織彈性及張力適中，毛細血管充盈正常，和周圍組織一致；動脈危象組皮瓣蒼白灰暗，皮溫降低，皮瓣張力減低，毛細血管反應稍遲鈍；靜脈危象組在0～1 h，皮瓣顏色逐漸加深，皮溫降低，皮瓣腫脹，毛細血管反應稍加快；靜脈危象1～2 h，皮瓣表面逐漸出現散在的瘀點；靜脈危象4 h組斑點逐漸融合成片狀青紫瘀斑，直至皮瓣變黑壞死（圖2）。

圖2 皮瓣大體觀察Fig 2 Gross observation of the skin flaps

2.2 ICGA檢測結果

靜脈注射ICG后，在30 s時各組周圍組織MFI達到最大，為（193.4±17.8）AU，之后逐漸變小。在 30～300 s，熒光衰減較為迅速，300 s時 MFI為（62.9±11.0）AU；300 s后熒光衰減緩慢。約15 min時，ICG代謝消失，周圍組織MFI恢復至術前基線水平，為（36.1±6.2）AU。

對照組在注射后5～8 s后，皮瓣內髂腰動脈開始顯影，可以清晰觀察到動脈期、毛細血管期、靜脈期。動脈期時間非常短暫，約2～3 s，血管纖細，呈 “樹枝狀”影，供應皮瓣中央區域；之后迅速經過毛細血管交換進入靜脈期，靜脈期維持時間較長，靜脈血管稍粗大（圖3）。皮瓣和周圍組織MFI在30 s達到峰值后逐漸變小，并且在不同時間點基本保持同步變化（圖5）。

圖3 對照組血液灌注分期Fig 3 Blood perfusion staging of the control group

動脈危象組皮瓣無灌注分期，在觀察期各時間點均呈現“暗區”，MFI為（34.9±5.8）AU，與基線水平無明顯差異（P＞0.05）；在注射后 30 s時，RPV為（18.1%±1.2%），與靜脈危象 2、4 h組無統計學差異（P＞0.05）（圖 4～6）。

靜脈危象各組無灌注分期，皮瓣和周圍組織MFI變化不同步。靜脈危象15 min皮瓣MFI在30～300 s

始終大于周圍組織，而危象0.5、1、2 h組皮瓣MFI在觀察初期小于周圍組織，繼而大于周圍組織；靜脈危象2 h皮瓣內熒光“混沌”，血管形態難以辨認。靜脈危象4 h組皮瓣始終呈現“暗區”，MFI在各時間點始終處于基線水平。在注射后30 s時，靜脈危象15 min組皮瓣 RPV為（112.8%±3.8%），大于對照組RPV（95.9%±1.0%）；隨著靜脈危象程度加深，皮瓣RPV逐漸變小，均小于對照組（P＜0.05）（圖 4～6）。

圖4 各組皮瓣熒光動態變化Fig 4 Dynamic changes of fluorescence in the flaps of the groups

圖5 皮瓣和周圍組織平均熒光強度定量分析Fig 5 Quantitative analysis of MFI of the flaps and surrounding tissues

圖6 注射ICG 30 s時皮瓣相對灌注分析Fig 6 Relative perfusion analysis of flaps at 30 s after injection of ICG

3 討 論

游離皮瓣已成為口腔頜面部組織缺損修復重建的主要手段。雖然游離皮瓣移植成功率已達95%以上，但發生皮瓣壞死仍是災難性事件［8］。血管危象作為皮瓣術后最常見的并發癥，其可能導致二次手術、皮瓣壞死等后果，不僅增加患者身心痛苦及延長住院時間，延誤后期放療，甚至危及生命［9］。皮瓣手術成功不僅取決于顯微外科吻合技術，還與術后監測密切相關。早期發現皮瓣危象與皮瓣挽救成功率直接相關［10－11］。術后24～48 h內是監測關鍵時期，血管危象多發生于此期間，且此類患者的皮瓣挽救成功率高于危象48 h后的患者。有研究報道，出現血運障礙后6 h內，皮瓣挽救成功率較高；隨時間延長，血管內膜受損，組織瓣微循環將發生不可逆改變，超過6 h血管危象挽救成功率低至14.3%。馬小睦等［12］回顧分析指出大部分血管危象可在發現后3 h內經手術探查解除。因此，早期識別并準確處理血管危象，是進一步提高游離皮瓣移植成功率的關鍵。目前皮瓣術后血運監測主要有臨床監測法、激光多普勒血流儀、近紅外光譜儀、植入式多普勒超聲、組織氧分壓測定和微量滲析等方法［13］。臨床觀察法簡單易行，但有賴于醫師個人經驗。目前尚沒有一種方法能達到理想的評估標準：實時、準確、無創、可定量、反應快捷，簡單方便［2］。以ICG為示蹤劑的近紅外熒光成像系統接近滿足這些標準［14］。對于發生過皮瓣危象探查術后的皮瓣，尤其是靜脈危象探查術后的皮瓣，其因淤血原因往往顏色較深，臨床評估往往不可靠，而ICGA評估血運不受組織形態色澤等因素干擾。ICG靜脈注射后，快速與血紅蛋白結合，被限制在血管內而無法短時間滲入組織間隙，被激發后發出波長700～900 nm熒光，具有更好的組織穿透性，在可見光下比其他染料更清晰顯示血液循環情況，通過測定研究區域熒光強度客觀準確反映組織灌注量。本文的實驗方法也適用于手術探查后的皮瓣監測。本實驗首次將FLI-10B用于穿支皮瓣血管危象監測的動物研究。以往研究多集中在ICGA結合動態指標如動脈流入指數、靜脈回流指數、熒光達峰時間等參數監測術后游離皮瓣［12］。Hitier等［13］研究發現，ICGA比臨床觀察法更早發現皮瓣術后微循環障礙（皮瓣危象患者熒光曲線斜率和振幅異常），證實其在預測血管危象的可行性和安全性。ICGA結合FLOW 800分析系統［14］、針刺實驗［15］可提高其檢測血管病變的靈敏度和特異度，在預測皮瓣壞死有著潛在價值。但運用動態指標需多次注射，無法持續監測血流灌注情況。并且不是所有堵塞類型都能被檢測出來［12］。Mucke等［16］研究發現 ICGA僅可檢測到堵塞程度≥85%的靜脈回流不暢，≤75%時無顯著性差異。總體來說，動態指標還不夠靈敏，并且在不同患者和不同皮瓣間無統一標準。

本實驗對測量指標加以改進，使用靜態指標如平均熒光強度和相對灌注值在不同時間點比較皮瓣和周圍組織熒光強度隨時間的變化，更能體現自身對照原則。并且單次注射，避免多次注射殘留造影劑對實驗造成影響。本研究結果表明，根據定性或定量指標并結合其他監測手段可推斷血管危象的類型和大致時間（圖7）。對照組皮瓣灌注有明顯灌注分期，并且皮瓣MFI變化與周圍組織保持同步變化，30 s時RPV接近100%，說明正常皮瓣血液灌注量和周圍組織相當，皮瓣內微循環正常。若皮瓣MFI在觀察期始終處于基線水平，并且30 s RPV較小（20%左右）則是動脈發生堵塞或者是靜脈危象時間過長導致皮瓣不可逆改變，血供中斷致造影劑無法流經皮瓣。動脈危象一般發生在術后24 h內，比靜脈危象發生時間早，而動脈危象表現不典型多無顏色改變，行ICGA有助于及早檢出動脈危象。若圖像顯示皮瓣在觀察期有熒光亮區，且MFI不下降則提示靜脈危象，靜脈回流不暢所致；靜脈危象發生率遠高于動脈危象，靜脈危象常常是術后皮瓣壞死的主要原因［17］。通過前期預實驗，當大鼠髂腰穿支靜脈阻斷4 h，所有皮瓣大體觀均已發黑壞死，當阻塞解除后，血液無復流，皮瓣無好轉，已發生不可逆壞死。靜脈危象超過4 h，皮瓣已無搶救成功的可能性。并且臨床上大部分靜脈危象主要靜脈引流不暢逐漸形成，很少出現完全阻塞情況，可能造成此實驗大鼠皮瓣靜脈危象搶救窗口期時間較短。所以認為靜脈阻斷4 h是關鍵時間節點，對大鼠皮瓣影響較大，大部分皮瓣無法生存。在0～4 h內，通過設置不同的阻斷時長，表示不同的靜脈危象程度。當靜脈危象程度較淺（15min）時，動脈流入正常，30 s RPV高于100%，ICG流入該區域無法及時通過靜脈排空，皮瓣內ICG代謝減緩，熒光強度高于周圍組織。隨著程度加深，皮瓣熒光峰值比周圍組織低并且峰值變鈍，30 s RPV逐漸減小，提示靜脈回流障礙使毛細血管床阻力增加，動脈壓增大，血液灌注減少所致，皮瓣內熒光強度低于周圍組織。當皮瓣靜脈危象至終末階段（2～4 h），靜脈危象時間過長導致皮瓣動脈不可逆損傷，皮瓣整體發生缺血，30 s RPV表現和動脈危象組一致，此時皮瓣熒光圖像“混沌”，無法顯示血管形態，血管通透性增大，ICG滲透到組織間隙混淆了血管亮度。

圖7 血管危象熒光顯像判定決策圖Fig 7 Suggested algorithm for decision making assisted by ICGA in regard to vascular crisis

本研究為動物實驗，存在一定的局限性。此研究采用結扎血管的方式模擬血管危象，但臨床上栓塞多逐漸形成，很少出現短時間完全堵塞的情況，大多為吻合質量不佳、組織或者積液壓迫、血管扭曲彎折等問題。如何更好的模擬臨床情況，還需要對模型進一步改善。目前本實驗是選取代表性時間點觀察，如何持續動態監測，第一時間發現血管危象還需進一步研究。大鼠與人的皮瓣生理不同，下一步本課題研究將在體借助Real-IGSFLI-10B研究ICGA在術后穿支皮瓣監測中的可行性，在臨床上給予驗證。

4 結 論

此實驗可表明ICGA可用于穿支皮瓣術后血運監測，根據熒光顯像模式和動態定量分析可鑒別血管危象類型和判斷危象發生時間，從而及時采取挽救措施，提高皮瓣挽救成功率。