小麥乙烯轉錄因子TaERF2響應濕害脅迫的表達分析

宋桂成 周淼平 余桂紅 姚金保 馬鴻翔

(1 江蘇省農業科學院糧食作物研究所，江蘇 南京 210014；2 揚州大學農學院，江蘇 揚州 225009)

低氧脅迫是濕害造成植物代謝途徑改變和生長減緩的主要原因，乙烯響應因子(ethylene-responsive factor，ERF)是植物應答非生物脅迫信號傳導和調控相關基因表達的一類重要轉錄因子[1]。ERF是APETALA2/ethylene-responsive factor(AP2/ERF)的一個亞家族成員，含有至少一個保守的AP2/ERF結構域，大約由60個氨基酸組成[2]。ERF蛋白可以直接結合GCCbox或DRE/CRT順式作用元件，調控靶基因的表達[3]。AP2/ERF的亞族成員含有各自保守的氨基酸序列結構和功能特征，參與植物濕害或低氧脅迫等非生物脅迫的表達調控[4]。研究發現，ERF通過參與植物激素合成、代謝物合成、活性氧(reactive oxygen species，ROS)清除等多種途徑調節濕害或低氧脅迫等非生物脅迫應答[5]。淹水條件下，SNORKEL1和SNORKEL2可以誘導合成大量的赤霉素(gibberellin，GA)，GA可以促進水稻莖部伸長生長，使受淹葉片伸出水面，進行有氧呼吸，提高深水稻在完全淹沒條件下的耐淹性[6]。Yamauchi等[7]研究發現，低氧脅迫下乙稀合成前體1氨基環丙烷羧酸(1-cyclopropane carboxylic acid，ACC)處理小麥幼根，能增加煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶相關基因的表達，促進ROS合成，進而調控細胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)相關信號通路，形成通氣組織。ERF蛋白通過結合乙烯啟動子區域GCCbox或DRE調控原件，促進乙烯合成，進而影響相關基因表達，形成通氣組織，提高植株對濕害或低氧的抗性。Christianson等[8]通過對淹水處理的棉花進行轉錄組分析發現，淹水24 h后，受脅迫影響差異表達的1 305個基因中，ERFs主要參與激素合成、淀粉和氮代謝等途徑，是調控植株濕害應答的重要響應因子。大豆ERFVII1、ERFVII4、ERFVII5和ERFVII8基因受濕害、低氧脅迫和外源乙烯的誘導表達，是大豆耐濕的重要響應因子[9]。前人研究發現，擬南芥ERF-Ⅶ家族的ERF主要參與低氧脅迫的應答，如RELATEDTOAPETALA2.2(RAP2.2)、RAP2.12通過啟動子區域GCCbox或DRE順式元件調控缺氧反應基因的表達，使植株適應缺氧環境[10-12]。

濕害造成低氧脅迫是導致小麥(TriticumaestivumL.)減產的主要因素之一[13]。研究小麥耐濕分子機制，挖掘調控耐濕的關鍵基因對提高小麥耐濕性和產量尤為重要[14]。在模式植物擬南芥和模式作物水稻中，ERF基因調控植株個體適應低氧脅迫環境的機制已較為完善[11-12]，但在小麥中該基因仍有待深入研究。因此，挖掘和探索小麥耐低氧脅迫相關的ERF基因對提高小麥的耐濕性和產量有重要意義。

目前研究已發現小麥AP2/ERF家族基因有117個，ERF亞族共47個，雖已明確其中多數基因參與抗旱[15]、耐鹽[16-17]、低溫脅迫[16]等多種非生物脅迫應答[15-17]，但ERF與濕害脅迫的關系和分子機制尚不清楚。Kim等[18]研究發現CRISPR/Cas9編輯TaERF3和TaDREB2可以顯著提高小麥的耐干旱能力；Xu等[15]研究發現小麥TaERF2基因參與干旱、高鹽和低溫等非生物脅迫應答反應，可增強小麥多種脅迫的抗性；Makhloufi等[19]通過篩選硬質小麥(TriticumturgidumL.subsp.durum)的BAC文庫獲得TdERF1基因，并發現TdERF1與TaERF2、TaERF1有較高的同源性，同樣參與鹽脅迫、低溫等非生物脅迫應答。因此，本研究分析TaERF2的結構域，以及與耐濕相關基因AtRAP2.12、AtRAP2.2和AtRAP2.3等的同源性，以期明確TaERF2的耐濕機制，對小麥耐濕性的遺傳改良提供重要科學意義和應用價值。

1 材料與方法

1.1 ERF系統發育樹構建和分組

參照Licausi 等[11]和Hess等[12]已報道的擬南芥AP2/ERF蛋白序列，采用BLAST query工具檢索普通小麥品種中國春IWGSCv1.0注釋蛋白序列(參數為E<1e-10，Identity>50)，獲得小麥AP2/ERF序列(圖1)。將獲取的小麥ERF序列與擬南芥耐濕相關的ERF成員進行Clustal X[20]序列比對分析，由特征序列分離出小麥耐濕相關的ERF基因。根據NCBI注冊號下載已克隆小麥相關ERF蛋白序列，利用Clustal X軟件對擬南芥、水稻、大豆和玉米耐濕ERF基因與小麥ERFs氨基酸序列進行多重序列比對分析，并用MEGA 6.0軟件[21]通過鄰接法構建系統發育樹。所有基因ID詳見圖2。根據進化樹及擬南芥AP2/ERF分組確定小麥中ERF基因的分組。

1.2 TaERFs基因組織表達差異分析

耐濕品種寧麥9號(江蘇省農業科學院糧食作物研究所選育，耐濕品種[22])、不耐濕品種鄭麥1354(河南省農業科學院提供，不耐濕品種)，用于濕害處理和反轉錄PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)試驗。將長勢一致的三葉一心小麥幼苗進行盆缽濕害脅迫處理，待水沒過幼苗土表以上部分2 cm，于不同時間點(0、2、4、8、12、24、48、72、96 h和處理后第48小時)對根系和葉片進行取樣，液氮速凍，-80℃冰箱中保存用于提取RNA。用R6827-01RNA提取試劑盒(Omegabio-Tek, 廣州)提取樣品總RNA，使反轉錄試劑盒(TaKaRa，日本)將總RNA反轉錄為cDNA。2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒(大連寶生物有限公司)進行RT-PCR試驗，Actin(登錄號AB181991)為內參基因，所有引物列于表1。每個反應重復3次，所得結果采用2-△△CT方法計算分析[23]。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3 TaERF2蛋白結構域和同源性比對分析

采用在線軟件MEME4.9對TaERF2蛋白序列進行保守基序分析，搜索motif值為16，基序長度范圍為5～200個氨基酸殘基，基序最小為10，其他值設為默認參數。TaERF2蛋白結構域通過SMART(http://smart.embl-heidelberg.de)數據庫分析確定。NCBI中下載水稻和擬南芥已報道的耐濕ERF與小麥ERF蛋白序列，利用MNAMAN5.0進行同源性比對分析。

1.4 TaERF2基因結構和啟動子順式元件分析

利用GSDS在線軟件分析TaERF2基因是否含有內含子及內含子的數量、TaERF2外顯子和內含子位置信息，并繪制TaERF2基因的結構。利用PlantCARE數據庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對TaERF2基因起始密碼子前2 000 bp的基因組序列進行啟動子元件分析。

1.5 TaERF2的原核表達分析

根據BioXM2.6.0(http://home.njau.edu.cn/～bioxm)軟件對TaERF2基因ORF的酶切位點分析，設計用于擴增TaERF2基因ORF的引物對pGEX-TaE2-F：5′-C C G C T C G A G A T G T G C G G C G G C G C C A T C C T-3′與pGEX-TaE2-R：5′-G A C G T C G A C G T A G A A A C C A G C A G A C A A G G G-3′，上述引物對包含XhoI和SalI酶切位點。以TaERF2-T1 質粒為模板，PCR擴增引入酶切位點，50 μL擴增體系：TaERF2-T1質粒模板(100 ng·μL-1)1 μL，2×Phanta Max Master Mix 25 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各 2 μL，ddH2O 20 μL，擴增程序：95℃預變性3 min；95℃變性10 s，58℃退火15 s，72℃延伸50 s，32個循環；終72℃延伸5 min。電泳檢測PCR產物，切膠回收目的片段，獲得純化的目的片段。將純化的目的片段與pGEX-4T-1質粒雙酶切后進行連接，連接產物轉化DH5α，轉化DH5α涂于培養基進行培養，挑單克隆搖菌，菌液PCR檢測，測序，獲得正確的含有雙切位點質粒。采用熱激法將重組質粒載體pGEX-TaERF2導入大腸桿菌BL21，對轉化后的BL21菌株進行平板篩選，并挑單克隆擴繁，于-80℃菌液中保存備用。

將pGEX-TaERF2的BL21菌液接種于新鮮的100 mL 含有氨芐的LB培養基中，37℃振蕩培養至生長期OD600=0.8，然后從10 mL擴大培養物中取2 mL菌液作為空白對照，其余8 mL菌液加入80 μL 0.1 mol·L-1異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopranoside, IPTG)至終濃度達到1 mmol·L-1。37℃誘導培養，分別于2、4、6、12和24 h吸取1 mL菌液，8 000 r·min-1離心8 min收集菌體。將收集的菌體加入100 μL 2×十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)上樣緩沖液，使沉淀溶解懸浮，煮沸10 min，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，用5%濃縮膠、10%分離膠進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)，分析目的蛋白的表達情況。

2 結果與分析

2.1 TaERF2蛋白結構的分析

對TaERF2的氨基酸序列分析發現，TaERF2含有典型的AP2/ERF結構域(圖1-A橢圓框)，典型的YRG和RAYD元件(圖1-B)，并且含有3個堿性的核定位信號區和1個酸性激活區，1個磷酸化位點和4個潛在的糖基化位點(圖1-A)。同源比對發現，TaERF2與擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)RAP2.2、RAP2.12、RAP2.3、HRE1、HRE2[11,21]和水稻(OryzasativaL.)SNORKEL1、SNORKEL2[6]的耐漬基因同源性較高。

注：A：TaERF2保守域：黑色下劃線表示堿性的核定位信號區，長方形方框表示酸性激活區，橢圓方框表示ERF結構域，旗幟陰影區表示磷酸化位點，星號區表示N端潛在的糖基化位；B：TaERF2與其他物種氨基酸序列的多重比對：YRG和RAYD是組成AP2/ERF結構域的兩個主要基序。

2.2 TaERF2在AP2/ERF家族中類別的分析

為探究小麥TaERF2與其他物種ERF耐濕基因的同源進化關系和分組情況，將擬南芥[24-25]、水稻、大豆(GlycinemaxL.)、玉米(ZeamaysL.)AP2/ERF家族中耐濕ERF[26]與小麥TaERF2及已報道的多種脅迫抗性TaERF1[15]、抗旱和耐鹽TaERF3[17,27]構建系統進化樹。由圖2可以看出，TaERF2(AAP32468.1)屬于ERF亞族的B2組，與擬南芥ATRAP2.2(AT3G14230.1)、ATRAP2.12(AT1G53910)、ATRAP2.3(AT3G16770)[11]和水稻OsEREBP1(AAF23899.1)[6]屬于同一亞族。

圖2 AP2/ERF基因家族的系統進化樹分析

2.3 小麥ERFs在根葉中的表達

為進一步驗證TaERF2與小麥耐濕的關系，在寧麥9號根和葉組織中，將已經報道的小麥抗逆相關ERF基因TaERF3(GenBank: EF570122.1)、TaERF6(GenBank: JN681188.1)、TaERFBP(GenBank: AF542184.1)、TaERF4a(GenBank: JN681189.1)、TaERF4b(GenBank: JN681190.1)、TaERF5a(GenBank: JN681191.1)、TaERF5b(GenBank: JN681192.1)與TaERF2(GenBank: AAP32468.1)進行表達分析。由圖3可知，受濕害脅迫條件下，小麥葉中TaERF2的表達情況為：2 h時其表達量與其他7個ERF基因有顯著差異(圖3-A)，4 h時其表達量與TaERF6、TaERF5b有顯著差異(圖3-C)，12、24、48 h時其表達量與其他7個ERF基因均無顯著差異(圖3-E、G、I)；小麥根中TaERF2的表達情況為：漬水處理2、4、12、24、48 h 時其表達量與其他7個ERF基因有顯著差異(圖3-B、D、F、H、J)，且漬水處理2、4 h時其表達量最高；TaERF2在小麥根中的表達量高于葉片中的表達量，而其他7個ERF基因在小麥根和葉中表達量差異均不顯著。

注：A、C、E、G、Ⅰ: 濕害處理2、4、12、24、48 h，TaERF2、TaERF3、TaERF6、TaERFBP、TaERF4a、TaERF4b、TaERF5a和TaERF5b在葉中表達；B、D、F、H、J：濕害處理2、4、12、24、48 h，TaERF2、TaERF3、TaERF6、TaERFBP、TaERF4a、TaERF4b、TaERF5a和TaERF5b在根中表達。不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著。

2.4 TaERF2基因結構和啟動子區域分析

將TaERF2的mRNA全長序列與小麥基因組數據庫Blast比對分析，結果如圖4-A所示，TaERF2基因含有2個外顯子和1個內含子，第1個外顯子長度為262 bp，第2個外顯子長度806 bp，內含子長度為874 bp。采用plantCARE對TaERF2基因上游2 000 bp區域的順式元件分析發現，啟動子區域含有3個缺氧誘導和厭氧誘導的順式元件，1個ARE為缺氧誘導的順式元件，2個GC-motif為厭氧誘導的順式元件(圖4-B)。另外，還有4個ABRE參與ABA響應的順式元件，1個TATC-box參與GA響應的順式元件，1個TCA-element參與SA響應的順式元件。由上述結果推測，TaERF2可能受低氧或缺氧誘導參與小麥耐濕調控。

注：B：ABER：參與脫落酸反應的順式作用元件；ARE：無氧誘導的重要順式作用調節元件；CAT-box：與分生組織表達相關的順式作用調節元件；CGTCA-motif: 參與茉莉酸反應的順式作用調節元件；EIRE：激發子反應元件；GC-motif：參與缺氧特異性誘導的增強子元件；MBS：參與干旱誘導的MYB結合位點；TATC-box：參與赤霉素反應的順式作用元件；TCA-element：參與水楊酸反應的順式作用元件。

2.5 不同耐濕性小麥品種中TaERF2基因的表達差異分析

由圖5可知，小麥葉片中，濕害脅迫處理2、4 h時，TaERF2在耐濕品種寧麥9號和不耐濕品種鄭麥1354葉片中的表達量最高，除2、24、72和96 h外，TaERF2在耐濕和不耐濕品種葉片中的表達量間無顯著差異；小麥根系中，TaERF2在寧麥9號根中的表達顯著高于鄭麥1354，且在2和4 h時表達量較高，顯著高于其他時間點的表達量；漬水處理2和4 h時，寧麥9號根中TaERF2的表達顯著高于葉片，其他處理時間點無顯著差異，漬水處理4～96 h時，TaERF2在鄭麥1354葉片中的表達量均顯著高于根；停止漬水處理后48 h，寧麥9號和鄭麥1354根和葉中TaERF2的表達均無顯著差異。

圖5 TaERF2在寧麥9號和鄭麥1354葉、根的表達

2.6 小麥TaERF2基因原核表達

以空載PGEX-4T-1轉入感受態BL21為對照，在1 mmol·L-1IPTG、28℃誘導24 h條件下觀察重組融合蛋白的表達。將重組表達菌株破碎裂解后的上清液SDS-PAGE電泳檢測，如圖6所示，在32～48 kDa之間有特異條帶；由于表達的TaERF2蛋白預測大小為39.25 kDa，該特異條帶與預測的大小基本吻合，說明該重組蛋白可以按照試驗設計正確表達目的蛋白，并且由條帶的寬度與染色程度可看出，重組蛋白在2 h開始大量表達，2 h后表達量明顯降低。

注：M: 蛋白Marker；1: IPTG誘導的pGEX-4T-1空載；2: pGEX-TaERF2誘導2 h；3: pGEX-TaERF2誘導4 h；4: pGEX-TaERF2誘導6 h；5: pGEX-TaERF2誘導12 h；6: pGEX-TaERF2誘導24 h。

3 討論

濕害是影響小麥生產的世界性自然災害[4]。長江中下游稻麥輪作麥區是我國的濕害重災區，特別是小麥拔節到成熟期，降雨造成的濕害可導致小麥減產[13,28]。研究表明，小麥的耐濕性受相關基因的調控，特別是一些調控非生物脅迫的ERF基因[29]。小麥TaERF1基因含有典型AP2/ERF結構域，參與干旱、高鹽和低溫等非生物脅迫應答[15]；二粒小麥TdERF1基因同樣含有AP2/ERF結構域，并發現該基因與TaERF1具有相似的功能，且同樣參與上述非生物脅迫應答[19]。本研究發現，TaERF2氨基酸序列含有1個典型的AP2/ERF結構域(圖1)，其磷酸化位點、核定位信號區和酸性激活區與AtRAP2.12的結構特征相同[25]。TaERF2與擬南芥RAP2.3、RAP2.12和RAP2.2及TdERF1、TaERF1OsSNORKEL1等有較高的同源性，同屬于AP2/ERF家族的B2組(圖2)。上述結果表明，TaERF2可能具有與擬南芥AtRAP2.12、AtHRE1[11,25]、水稻OsSNORKEL1[6]等基因相似的功能，參與小麥濕害脅迫應答。

通過對小麥葉和根中TaERF2、TaERF3、TaERF6、TaERF4a、TaERF4b、TaERF5a和TaERF5b的表達分析發現(圖3)，漬水脅迫后TaERF2在小麥根中的表達顯著高于其他小麥ERFs基因的表達，并且在根中特異表達，表達量遠高于葉片。雖然Xu等[15]和Rong等[17]研究發現TaERF1和TaERF3參與小麥多種非生物脅迫應答，但未明確其參與耐濕應答，且本研究并未發現濕害脅迫下TaERF3在根、葉中的表達有差異(如圖3)，且表達量低于TaERF2，因此其參與小麥耐濕應答的機制仍需進一步證實。

研究表明，小麥ERFs基因可能存在功能特異性，參與不同的非生物脅迫應答。對TaERF2基因結構和啟動子區域進一步分析發現，TaERF2含有2個外顯子和1個內含子，其上游啟動子區域含有ABA、GA和SA等激素、缺氧厭氧順式元件(圖4)，表明TaERF2參與濕害脅迫的響應。TaERF2在耐濕品種寧麥9號和不耐濕品種鄭麥1354中的表達模式不同，TaERF2在寧麥9號根中的表達量顯著高于鄭麥1354，此外受濕害脅迫2 h后TaERF2在寧麥9號根系中大量表達，可能與寧麥9號具有較高耐濕性有關。原核表達的結果表明，TaERF2受誘導2和4 h后可快速啟動表達，這與在寧麥9號根中的表達模式相似，推測TaERF2可能參與了濕害脅迫應答，并且受到脅迫后可快速應答。

4 結論

本研究對TaERF2蛋白結構、基因結構、啟動子區域及表達進行了探究，結果表明，TaERF2與擬南芥AtRAP2.12、AtHRE1和水稻OsSNORKEL1、OsSNORKEL1有較高的同源性，且啟動子區域含有缺氧厭氧順式元件，推測TaERF2可能為小麥濕害脅迫響應基因。受濕害脅迫后，TaERF2在小麥根系中特異表達，在耐濕小麥品種寧麥9號根系中顯著上調表達，而在不耐濕小麥品種鄭麥1354根系中無明顯變化。原核表達結果顯示TaERF2可以快速響應pGEX-TaERF2誘導，與寧麥9號根中的表達模式相似。本研究證實TaERF2在小麥耐濕中具有一定的調節作用，為進一步明確AP2/ERF轉錄因子對小麥耐濕的分子調控作用提供了重要理論依據。