黑果枸杞高效植株再生與遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

張 虹 安迎瑞 張 君 郎思睿 陳 任

(寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/寧夏優(yōu)勢(shì)特色作物現(xiàn)代分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 寧夏 銀川 750021)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurray)為茄科枸杞屬多棘刺灌木，多分布于干旱鹽堿的荒漠與半荒漠地區(qū)，具有防治水土流失、防風(fēng)固沙、鹽堿地改良等生態(tài)防治作用[1-3]。在藥用保健方面，黑果枸杞富含多糖、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分[4-5]。此外，黑果枸杞含有天然原花青素，是一種能夠有效消除人體內(nèi)自由基的天然抗氧化劑，同時(shí)花色苷具有抗輻射及減少細(xì)胞凋亡作用[6-8]。黑果枸杞的藥用和保健價(jià)值高于紅枸杞，被譽(yù)為植物“軟黃金”[9-10]。因此，黑果枸杞是具有環(huán)境保護(hù)、藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的樹種[11]。采用生物技術(shù)挖掘黑果枸杞種質(zhì)資源庫(kù)優(yōu)良性狀基因，并將其應(yīng)用于品種改良是黑果枸杞產(chǎn)業(yè)鏈持續(xù)發(fā)展的源頭工程，建立高效穩(wěn)定的黑果枸杞轉(zhuǎn)化體系可以為這一工程提供技術(shù)基礎(chǔ)。

近年來(lái)，關(guān)于寧夏枸杞種內(nèi)品種的遺傳轉(zhuǎn)化建立有較多的研究，并取得了相應(yīng)的成果。如趙亞華等[12]采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源基因轉(zhuǎn)入枸杞幼莖，經(jīng)分析檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因植株中的鋅含量是對(duì)照的2倍多。杜國(guó)利等[13]利用含有目的基因的農(nóng)桿菌侵染枸杞葉片，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)，初步建立了具有HIV殼體蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)。劉丹如等[14-15]對(duì)杜國(guó)利的研究進(jìn)一步優(yōu)化，建立了利用轉(zhuǎn)基因枸杞毛狀根進(jìn)行外源HIV-1殼體蛋白表達(dá)的系統(tǒng)。雖然上述研究都獲得了轉(zhuǎn)基因?qū)幭蔫坭剑?yáng)性植株獲得率極低，極大地限制了枸杞分子生物學(xué)的研究。王靜等[16]以黑果枸杞下胚軸為外植體材料建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，對(duì)外源基因轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行檢測(cè)分析，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率為16%，但以植株下胚軸為實(shí)驗(yàn)材料，存在取材成本較高的限制。本試驗(yàn)以黑果枸杞葉片為材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將外源綠色熒光選擇標(biāo)記(synthetic green-fluorescent protein with S65T mutation，sGFP)基因?qū)牒诠坭剑?jīng)愈傷組織、不定芽誘導(dǎo)和抗生素選拔以及生根培養(yǎng)，將獲得的再生植株經(jīng)PCR鑒定，確定陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株導(dǎo)入外源基因的表達(dá)量，從而建立一套高效的黑果枸杞遺傳轉(zhuǎn)化體系，旨在為今后利用基因工程培育黑果枸杞新品種奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院基因工程實(shí)驗(yàn)室繼代保存黑果枸杞無(wú)菌苗，根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105購(gòu)自北京全式金，雙元質(zhì)粒載體pKAFCR21為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建用于外源基因過(guò)表達(dá)研究，攜帶有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neomycin phosphotransferase Ⅱ, NPT Ⅱ)、潮霉素(hygromycin phosphotransferase, HPT)2個(gè)抗生素耐性基因，以及β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase, GUS)、綠色熒光蛋白(synthetic green-fluorescent protein with S65T mutation, sGFP)2個(gè)標(biāo)記基因，用于遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)的選拔和條件優(yōu)化[16]。

1.2 黑果枸杞再生體系的建立

1.2.1 外植體的選擇 將黑果枸杞葉片切至0.5 cm×0.5 cm大小，莖段0.5 cm，莖節(jié)0.5 cm，分別接種到植物組織培養(yǎng)用基本培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, MS)+ 0.2 mg·L-1萘乙酸(1-naphthaleneacetic acid, NAA)+ 0.5 mg·L-16-芐腺嘌呤(6-benzylaminopurine, BAP)的愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每皿接種25個(gè)外植體，每種外植體接種3皿，25℃光照培養(yǎng)4周。

1.2.2 激素濃度的選擇 將黑果枸杞葉片切至0.5 cm×0.5 cm大小，接種到不同激素濃度(見表3)組合的NAA和BAP的MS培養(yǎng)基上。25℃光照培養(yǎng)4周，觀察愈傷組織及不定芽生長(zhǎng)情況，并統(tǒng)計(jì)出愈率和出芽率。

1.2.3 生根培養(yǎng) 將愈傷組織分化的不定芽切下，接種到1/2 MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，15 d后根據(jù)生根植株數(shù)量計(jì)算生根率。

1.3 黑果枸杞遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

將黑果枸杞葉片切成0.5 cm×0.5 cm大小，置于OD600為0.25的農(nóng)桿菌侵染液(MS + 20 mg·L-1sucrose + 0.5 mg·L-1NAA + 0.3 mg·L-1BAP + 20 mg·L-1acetosyringone, pH值5.8)中分別侵染5、10、15 min后，用無(wú)菌濾紙吸去多余菌液，將其放入共培養(yǎng)基(MS + 20 mg·L-1sucrose + 0.5 mg·L-1NAA+ 0.3 mg·L-1BAP + 20 mg·L-1acetosyringone + 7 g·L-1agar, pH值5.8)中共培養(yǎng)3 d；共培養(yǎng)結(jié)束將葉片轉(zhuǎn)移至含有不同濃度組合的卡那霉素(kanamycin)和羧芐西林(carbenicillin)的愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)選拔培養(yǎng)基(MS + 20 mg·L-1sucrose + 0.5 mg·L-1NAA + 0.3 mg·L-1BAP +7 g·L-1agar, pH值5.8)中，3周后經(jīng)MZ10F熒光顯微鏡(Leica，德國(guó))篩選，將有熒光的抗性愈傷組織及不定芽轉(zhuǎn)移至相同成分的繼代增殖培養(yǎng)基上，待抗性不定芽伸長(zhǎng)后切成單株，轉(zhuǎn)移至1/2 MS生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。觀察愈傷組織及不定芽生長(zhǎng)情況，并統(tǒng)計(jì)出愈率和出芽率。

出愈率=愈傷組織個(gè)數(shù)/每種供試外植體總數(shù)×100%

出芽率=長(zhǎng)出不定芽的愈傷組織個(gè)數(shù)/愈傷組織總數(shù)×100%

陽(yáng)性愈傷率=表達(dá)sGFP的愈傷組織個(gè)數(shù)/愈傷組織總數(shù)×100%

生根率=生根苗/不定芽總數(shù)×100%

轉(zhuǎn)化率=陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株數(shù)/總再生植株數(shù)×100%

1.4 黑果枸杞遺傳轉(zhuǎn)化植株的鑒定

1.4.1 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定 轉(zhuǎn)基因再生植株用AD301 TransDirect Plant Tissue PCR Kit(北京全式金生物技術(shù))提取基因組DNA。利用PCR方法鑒定導(dǎo)入的基因片段，根據(jù)sGFP基因序列設(shè)計(jì)PCR特異引物(表1)，擴(kuò)增的目的片段大小為610 bp，擴(kuò)增時(shí)以未轉(zhuǎn)化植株葉片基因組DNA為陰性對(duì)照，質(zhì)粒pKAFCR21為陽(yáng)性對(duì)照。反應(yīng)體系20 μL：DNA模版2 μL, 2×PCR Master Mix(with dye)10 μL，正反引物各1 μL，ddH2O 6 μL，所用試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 5 min，94℃ 變性30 s，60℃退火30 s，72℃復(fù)性30 s，共32個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4.2 轉(zhuǎn)基因植株的sGFP表達(dá)量檢測(cè) 利用RE-05021植物多糖多酚總RNA提取試劑盒(成都福際生物技術(shù))分別提取轉(zhuǎn)基因植株和未轉(zhuǎn)基因植株RNA，為確保提取的RNA樣品本無(wú)DNA污染，在提取過(guò)程中加入DNase Ⅰ處理步驟。通過(guò)NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific)測(cè)定RNA濃度，各個(gè)樣本RNA在確認(rèn)提取檢測(cè)純度和完整性后稀釋成40 ng·μL-1。同時(shí)取各個(gè)樣本提的總RNA，混合后按4倍數(shù)稀釋成200、50、12.50、3.13、0.78、0.20 ng·μL-16個(gè)濃度作為標(biāo)準(zhǔn)線材料。

利用各個(gè)樣本提取的總RNA(40 ng·μL-1)，使用HiScript Ⅱ 1st Stand cDNA Synthesis Kit(R212-01, 南京諾唯贊生物科技)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用于后續(xù)使用qTOWER3G實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(德國(guó)Analytik Jena)進(jìn)行擴(kuò)增。

以黑果枸杞甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)基因?yàn)閮?nèi)參，采用Primer Express 3.0(Premier Biosoft，美國(guó))軟件設(shè)計(jì)內(nèi)參LrGADPH與sGFP熒光定量用引物序列(表1)。

表1 PCR擴(kuò)增引物

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)束后，根據(jù)程序給定的本底基準(zhǔn)線PCR Baseline Subtracted(PCR增殖達(dá)對(duì)數(shù)階段)，從擴(kuò)增曲線上讀取每個(gè)基因在各個(gè)樣本的循環(huán)閾值(cycle threshold, Ct)，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)線，獲得每個(gè)基因在各個(gè)樣本的起始質(zhì)量SQ值(starting quantity)。通過(guò)每個(gè)基因與內(nèi)參基因SQ的比值，計(jì)算出目的基因在各個(gè)樣本的質(zhì)量(視為基因相對(duì)表達(dá)量)和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行分析，采用SPSS 16.0進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果枸杞再生體系的建立

2.1.1 不同外植體愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo) 將黑果枸杞葉片、莖節(jié)、莖段接種到愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，4周后，不同外植體分化出的愈傷組織形態(tài)不同。由葉片分化而來(lái)的愈傷組織結(jié)構(gòu)較為緊密；由莖段分化而來(lái)的愈傷組織結(jié)構(gòu)較為疏松，易玻璃化；而莖節(jié)葉腋處不經(jīng)愈傷組織的形成可直接分化出大量不定芽(圖1)。不同外植體的愈傷組織形成效率不同，莖段的出愈率最高，其次為葉片，莖節(jié)出愈率最低。將不同外植體分化的愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，不同外植體來(lái)源的愈傷組織出芽效率不同，葉片愈傷組織出芽率最高，莖段愈傷組織出芽率次之，莖節(jié)愈傷組織出芽率最低(表2)。

注: A: 葉片分化; B: 莖段分化; C: 莖節(jié)分化; D: 愈傷組織增值; E: 不定芽; F: 不定芽生根。標(biāo)尺：15 mm。

表2 不同外植體的再生效率

2.1.2 不同激素濃度組合對(duì)葉片愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)的影響 將黑果枸杞葉片接種到不同濃度的NAA與不同濃度BAP配比的培養(yǎng)基上，進(jìn)行愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的優(yōu)化，培養(yǎng)4周后，出愈率和出芽率最適宜的培養(yǎng)基為MS+0.5 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-1BAP(表3)。

表3 不同激素濃度對(duì)葉片外植體再生的影響

2.1.3 生根誘導(dǎo) 將愈傷組織分化的不定芽切下，接種到1/2 MS + 20 mg·L-1蔗糖+ 7 g·L-1瓊脂(pH值5.8)培養(yǎng)基上進(jìn)行生根誘導(dǎo)，15 d后，生根率為95%(圖1-F)。

2.2 黑果枸杞遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

2.2.1 農(nóng)桿菌侵染時(shí)間的確定 將黑果枸杞葉片經(jīng)5、10、15 min不同時(shí)間侵染，共培養(yǎng)3 d后，接種到含25 mg·L-1卡那霉素以及250 mg·L-1羧芐西林的愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)選拔培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周后，熒光顯微鏡檢測(cè)sGFP基因表達(dá)情況，結(jié)果表明，不同侵染時(shí)間獲得的轉(zhuǎn)基因愈傷組織數(shù)量無(wú)顯著差異(表4)。

表4 侵染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響

2.2.2 抗生素濃度的篩選 經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后的黑果枸杞葉片在脫分化過(guò)程中易受到農(nóng)桿菌的污染，加入羧芐西林對(duì)農(nóng)桿菌增殖有著明顯的抑制作用，但較高濃度的羧芐西林會(huì)抑制不定生芽的分化。卡那霉素濃度過(guò)低不利于抗性組織的篩選，濃度過(guò)高不利于組織分化。本試驗(yàn)分別采用不同濃度的卡那霉素和羧芐西林聯(lián)合使用對(duì)轉(zhuǎn)基因植物材料進(jìn)行篩選(表5)，結(jié)果表明，在4種不同濃度的抗生素組合中，卡那霉素的濃度為25 mg·L-1以及羧芐西林為250 mg·L-1對(duì)農(nóng)桿菌的抑制作用較好，且不定芽分化效率最高，為50.14%。

表5 抗生素濃度的篩選

2.3 黑果枸杞遺傳轉(zhuǎn)化植株的鑒定

2.3.1 轉(zhuǎn)基因外植體分化過(guò)程中的GFP鑒定 因質(zhì)粒pKAFCR21含有sGFP基因，編碼綠色熒光蛋白。黑果枸杞葉片經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，在愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)選拔培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周后，采用熒光顯微鏡鑒定，能觀察到部分愈傷組織有sGFP的表達(dá)(圖2-A、D)，10 d后，部分愈傷組織分化出大量不定芽，其中的部分不定芽也有sGFP的表達(dá)(圖2-B、E)，將有熒光的抗性愈傷組織及不定芽轉(zhuǎn)移至含有抗生素的繼代增殖培養(yǎng)基上，部分愈傷組織繼續(xù)分化出大量不定芽，待抗性芽伸長(zhǎng)后切成單株，轉(zhuǎn)移至1/2 MS培養(yǎng)基上分化生根，形成完整的植株(圖2-C、F)。

注: A：可見光下轉(zhuǎn)基因愈傷；B：可見光下轉(zhuǎn)基因不定芽；C：可見光下轉(zhuǎn)基因幼苗；D: 熒光下轉(zhuǎn)基因愈傷；E：熒光下轉(zhuǎn)基因不定芽；F：熒光下轉(zhuǎn)基因幼苗。標(biāo)尺：2 mm。

2.3.2 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定 提取轉(zhuǎn)基因再生植株葉片基因組DNA，利用sGFP基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，非轉(zhuǎn)基因植株無(wú)目的條帶，陽(yáng)性對(duì)照pKAFCR21質(zhì)粒和轉(zhuǎn)基因植株在610 bp處有清晰的目的條帶(圖3)，表明利用該遺傳轉(zhuǎn)化體系可成功獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。

注: M: DL2000; +: pKAFCR21質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照;-: 非轉(zhuǎn)基因植株陰性對(duì)照; S1～S9:轉(zhuǎn)基因植株。

2.3.3 轉(zhuǎn)基因植株的sGFP表達(dá)量檢測(cè) 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)上述PCR鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行sGFP表達(dá)量檢測(cè)(圖4)，結(jié)果表明，以LrGADPH為內(nèi)參基因，5株轉(zhuǎn)基因植株sGFP均有較高的表達(dá)水平，而非轉(zhuǎn)基因植株無(wú)sGFP的表達(dá)。

注: 1, 4, 6, 10, 11:轉(zhuǎn)基因植株；CK: 非轉(zhuǎn)基因植株。

3 討論

3.1 黑果枸杞再生培養(yǎng)外植體的選擇

在植株再生培養(yǎng)過(guò)程中，合適的外植體選擇至關(guān)重要。黑果枸杞再生培養(yǎng)多選擇葉片、莖節(jié)或莖段，如李娜等[17]的研究，以無(wú)菌實(shí)生苗帶1～2個(gè)節(jié)的莖段為材料，可誘導(dǎo)莖段與培養(yǎng)基接觸的節(jié)處出現(xiàn)不定芽點(diǎn)，萌發(fā)出基莖叢生芽，其發(fā)生率可達(dá)100%，但是，此方法需要以大量的種子為基礎(chǔ)，試驗(yàn)成本較高，且個(gè)體間差異較大，不適用于構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化用植株再生體系。王靜等[16]以黑果枸杞下胚軸為外植體建立的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率為16%，同樣，此方法存在著外植體取材數(shù)量受限，試驗(yàn)成本較高，且操作較為繁瑣等缺點(diǎn)。與前人研究結(jié)果不同，本試驗(yàn)比較了不同外植體的再生效率，結(jié)果表明，繼代培養(yǎng)40 d左右的黑果枸杞葉片具有較好的植株再生能力，可能由于幼嫩的葉片具有較強(qiáng)的脫分化和再分化能力。因此，可選擇幼嫩的黑果枸杞葉片做為遺傳轉(zhuǎn)化用外植體，且在利用外植體進(jìn)行植株再生培養(yǎng)的過(guò)程中，以黑果枸杞葉片為外植體，具有取材量大、易操作等優(yōu)點(diǎn)。

3.2 黑果枸杞再生培養(yǎng)激素濃度的選擇

外植體的脫分化與再分化受不同種類和不同濃度激素的影響，當(dāng)NAA與BAP濃度配比合適時(shí)能相互協(xié)調(diào)的促進(jìn)外植體的再分化與生長(zhǎng)發(fā)育[18-19]。本試驗(yàn)中，BAP大于0.5 mg·L-1時(shí)，愈傷組織變得松軟，易玻璃化，不利于芽的分化，這與戴逢斌等[20]利用BAP誘導(dǎo)黑果枸杞不定芽分化的結(jié)果基本一致，可能是由于高濃度的BAP處理使得細(xì)胞處于旺盛的脫分化狀態(tài)，不利于愈傷組織再分化形成不定芽。此外，本試驗(yàn)中愈傷組織繼代15 d后每個(gè)愈傷組織的不定芽分化個(gè)數(shù)在13～18個(gè)，這與高思丹等[21]的研究結(jié)果一致，可能是合適濃度的NAA與BAP配比能夠促進(jìn)黑果枸杞不定芽數(shù)量的增加。當(dāng)生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比值小于1時(shí)，有利于愈傷組織分化出不定芽，與前人結(jié)果不同的是，本試驗(yàn)中，當(dāng)NAA為0.5 mg·L-1和BAP為0.3 mg·L-1時(shí)，愈傷組織仍能分化出大量不定芽，且在不定芽伸長(zhǎng)方面優(yōu)于NAA 0.3 mg·L-1和BAP 0.5 mg·L-1，可能是黑果枸杞葉片含有較高濃度的內(nèi)源性BAP，對(duì)外源BAP需求較少。因此，在黑果枸杞再生體系的建立中，可選擇較低濃度的激素對(duì)外植體進(jìn)行脫分化及再分化誘導(dǎo)，以促進(jìn)愈傷組織及不定芽的分化。

3.3 黑果枸杞遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

在植物遺傳轉(zhuǎn)化操作過(guò)程中，有效篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體至關(guān)重要，潮霉素、卡那霉素、除草劑是常用的抗性篩選劑，羧芐西林和頭孢霉素是常用的殺菌劑[22-23]。在茄科植物遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，蘇振華等[24]通過(guò)4個(gè)濃度的篩選，最終確定甜椒遺傳轉(zhuǎn)化最適的卡那霉素篩選濃度為50 mg·L-1，張明華等[25]在Btcry6A基因轉(zhuǎn)化茄子的研究中發(fā)現(xiàn)，75 mg·L-1的卡那霉素可以有效地抑制非轉(zhuǎn)基因外植體愈傷組織的產(chǎn)生；劉江娜等[26]建立的加工番茄新番72號(hào)遺傳轉(zhuǎn)化體系中，依次采用20、40和60 mg·L-1的卡那霉素對(duì)轉(zhuǎn)基因外植體進(jìn)行梯度篩選，其抗性愈傷組織誘導(dǎo)率為54.6%，抗性不定芽分化率達(dá)24.67%。劉雪霞等[27]對(duì)AtCKX2轉(zhuǎn)基因番茄進(jìn)行篩選時(shí)，卡那霉素的使用濃度高達(dá)80 mg·L-1，且對(duì)不定芽分化無(wú)影響。與前人結(jié)果不同，本試驗(yàn)將抗性篩選劑卡那霉素與抑菌劑羧芐西林共同使用對(duì)轉(zhuǎn)基因外植體進(jìn)行選拔，當(dāng)卡那霉素濃度為50 mg·L-1、羧芐西林濃度為250 mg·L-1時(shí)，能抑制農(nóng)桿菌增殖，減少對(duì)抗性不定芽分化的抑制。可能由于茄科不同種屬植物對(duì)抗生素的敏感程度不同，尤其黑果枸杞屬西北干旱耐鹽堿灌木，具有較高的抗逆性，因此葉片外植體可耐受較高濃度的抗生素。

農(nóng)桿菌菌液濃度同樣是遺傳轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵，王靜等[16]建立的遺傳轉(zhuǎn)化體系中農(nóng)桿菌侵染液OD600=0.5，在此高濃度下，外植體在后續(xù)分化過(guò)程中易增殖大量農(nóng)桿菌。與前人結(jié)果不同，本試驗(yàn)采用較低濃度的農(nóng)桿菌侵染液，即OD600=0.25的菌液侵染黑果枸杞葉片，共培養(yǎng)結(jié)束時(shí)未出現(xiàn)農(nóng)桿菌大量增殖，可能是較低濃度的侵染液中菌體數(shù)量較少，不易附著在外植體上，且在抗性篩選培養(yǎng)基上少量的菌體易被抗生素抑制。

在遺傳轉(zhuǎn)化獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株的過(guò)程中，轉(zhuǎn)基因組織的早期篩選可降低試驗(yàn)工作量，馮路路等[28]以GFP為報(bào)告基因，采用體式熒光顯微鏡從 2 978 個(gè)轉(zhuǎn)化外植體中鑒定得到3株表達(dá)GFP的再生苗，極大提高了轉(zhuǎn)基因植株的篩選效率。同樣地，本試驗(yàn)采用綠色熒光標(biāo)記sGFP的表達(dá)為抗性組織的篩選標(biāo)記，可在愈傷組織的形成時(shí)期篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因材料。不同的是，本試驗(yàn)在獲得轉(zhuǎn)基因不定芽及再生植株時(shí)，又利用sGFP基因的表達(dá)對(duì)陽(yáng)性植株進(jìn)行分子生物學(xué)的鑒定，進(jìn)一步驗(yàn)證了sGFP基因轉(zhuǎn)入后的高水平表達(dá)。因此，本試驗(yàn)建立的黑果枸杞遺傳轉(zhuǎn)化體系可降低試驗(yàn)操作過(guò)程中的工作量、提高轉(zhuǎn)化效率，為黑果枸杞種質(zhì)資源功能基因的挖掘奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

為建立高效的黑果枸杞遺傳轉(zhuǎn)化體系，本試驗(yàn)對(duì)植株再生體系及遺傳轉(zhuǎn)化體系中的關(guān)鍵因素進(jìn)行了探討，結(jié)果表明，最佳的植株再生用外植體為葉片，在MS + 30 mg·L-1sucrose + 0.5 mg·L-1NAA + 0.3 mg·L-1BAP培養(yǎng)基中，愈傷組織誘導(dǎo)率為88.56%，不定芽誘導(dǎo)率為54.54%，在1/2 MS培養(yǎng)基中，不定芽生根率為95%；遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)，農(nóng)桿菌侵染液濃度為OD600=0.25，在卡那霉素和羧芐西林分別為25和250 mg·L-1的篩選作用下，陽(yáng)性愈傷率為85.47%，陽(yáng)性植株轉(zhuǎn)化率為29%，與非轉(zhuǎn)基因植株相比，轉(zhuǎn)基因植株中的sGFP均有較高的表達(dá)水平。