不同泌乳期牛奶礦物元素特征及產地溯源研究

馬宇軒 謝立娜 譚麗芹 梁克紅 趙姍姍 郄夢潔 胡翔宇 趙 燕,*

(1中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所/農產品質量安全重點實驗室，北京 100081；2內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018；3遼寧省北票市長皋農業技術推廣站，遼寧 北票 122000；4 農業農村部食物與營養發展研究所，北京 100081)

牛奶作為高營養價值食品，富含礦物元素，對人體健康有積極作用。導致牛奶中營養元素含量出現差異的因素有物種[1-3]、地區來源[4-5]及泌乳期[6-7]等。隨著中國經濟的快速發展，乳制品行業取得了巨大進步，市場需求量也不斷增加。然而，三鹿奶粉事件和特侖蘇牛奶“OMP”事件的爆發不僅嚴重影響了中國的乳制品行業發展，而且嚴重損害了人民的利益。當乳制品出現問題時，可通過產地溯源技術跟蹤乳制品生產，追蹤其來源，確定其真實性，進而確保人民的利益。因此，建立乳制品產地溯源模型可以有效保障乳制品的安全及真實性，保護消費者合法權益。

礦物元素分析是確定農產品產地的一種有效方法。近年來，礦物元素技術在橄欖油[8]、梨[9]、牦牛肉[10]等多種農產品中用于追溯產地來源。國內外已開展了大量針對乳制品產地溯源的研究[11-14]。Vatavali等[15]、譚凱燕等[16]及Necemer等[17]通過測定乳及乳制品中礦物元素含量，對不同來源的乳及乳制品進行了有效判別。由此說明，礦物元素對不同來源的乳及乳制品具有良好的鑒別能力。除了乳類的產地來源，泌乳期也可能影響乳類中礦物元素的含量[18-20]。Miciński等[21]及Malacarne等[22]通過測定乳中礦物元素含量，發現不同礦物元素在不同泌乳階段含量不同。綜上，國內外基于礦物元素技術的泌乳期及產地溯源研究，大多針對奶酪及特種家畜乳等樣品，相關研究的樣本量及礦物元素測定較少，不同研究對泌乳期階段有不同劃分，導致不同泌乳階段對樣品中礦物元素的含量影響不同。此外，產地不同導致同規格或者同類型的牛奶價格產生較大差異，易出現摻假、造假及以次充好等相關安全問題。

本研究初步探討泌乳期3個階段對牛奶中12種元素(鈉、鎂、鉀、鈣、鈦、鉻、錳、鐵、鎳、鋅、鍶和鉬)含量的影響。在此基礎上，利用礦物元素含量區分我國不同地區的牛奶樣品。通過方差分析和偏最小二乘判別分析法對數據進行分析，并根據交叉驗證結果區分牛奶樣品的來源。最后，在確定牛奶樣品來源后獲得影響產地溯源的關鍵重要性因子(variable importance in the projection, VIP)。本研究利用礦物元素含量分析研究泌乳期不同階段及不同產地對牛奶中營養成分的影響，建立牛奶的產地溯源模型，以期為牛奶在泌乳期不同階段的研究提供思路及基礎數據參考，并為牛奶產地溯源研究提供理論依據，以保障乳制品安全及真實性，保護廣大消費者合法權益。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從4個地區(河北、寧夏、陜西和內蒙古)收集泌乳期3個不同階段(早期：30～90 d，中期：120～180 d，末期：210～270 d)牛奶樣品，并在-20℃條件下冷凍。分別從每個省的每個泌乳期各采集10個乳樣，每個乳樣50 mL，共計120個樣品。牛奶樣品的地理信息如表1所示。

表1 牛奶樣品地理信息表

1.2 材料與試劑

硝酸(色譜純)、氟化氫(色譜純)、甲醇(色譜純)，美國Fisher Scientific；其余試劑均為分析純。所用水均為超純水。標準物質為奶粉(GBW 10017)和雞肉(GBW 10018)，中國地質科學院地球物理地球化學勘查研究所。

1.3 儀器與設備

防腐烘箱，青島濟科實驗儀器有限公司；7500系列電感耦合等離子體質譜儀，美國安捷倫科技公司；H1850 臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.4 樣品制備及測定

將50 g牛奶樣品(鮮重)在-20℃條件下冷凍，然后將其在冷凍干燥機中冷凍干燥24 h并研磨成細粉。將凍干的牛奶置于離心管中，并以1∶5(g·mL-1)的固液比加入氯仿∶甲醇溶液(2∶1)，振動10 min，然后以5 000 r·min-1的速度離心5 min，用移液管移去上清液，重復此過程2次。離心管用穿孔薄膜密封，放在通風櫥中過夜。將樣品凍干并研磨均勻，將0.2 g脫脂干物質稱重放置到15 mL聚四氟乙烯消化罐中，向罐中加入0.6 mL硝酸和2 mL氟化氫，在150℃的防腐烘箱中消化12 h后打開蓋子，在120℃的防腐電熱板上將酸蒸發至接近干燥。將2 mL硝酸加入罐中，并將其置于150℃的防腐烘箱中12 h。最后，將消化罐內的溶液轉移到50 mL容量瓶中，用超純水定容，并通過0.45 μm無機過濾器進行分析。用電感耦合等離子體質譜儀對12種元素(鈉、鎂、鉀、鈣、鈦、鉻、錳、鐵、鎳、鋅、鍶和鉬)進行分析。用奶粉和雞肉標準物質校準牛奶樣品的元素值，對每個樣品進行3次分析，并使用外部標準分析進行量化，所有結果均表示為3次測量的平均值。內部標準包括鍺、釔、銠和鉑，用于確保儀器的穩定性。每當內標物的相對標準偏差高于5%時，重新測量樣品。

1.5 數據分析

用SPSS 22.0軟件進行數據分析。對礦物元素進行方差分析，當差異顯著時，進行Duncan多重比較以確定區域間的顯著差異，使用線性判別分析(linear discriminant analysis, LDA)評價礦物元素值對不同樣品來源的判別效果。利用SIMCA 14.1軟件進行偏最小二乘判別分析(partial least-squares discriminant analysis, PLS-DA)以區分不同產地的牛奶樣品，并通過計算礦物元素的重要性以確定影響產地溯源的關鍵重要性因子。

2 結果與分析

2.1 泌乳期不同階段牛奶礦物元素含量差異比較

泌乳期的3個階段(早期:30～90 d，中期:120～180 d，末期:210～270 d)中12種礦物元素(鈉、鎂、鉀、鈣、鈦、鉻、錳、鐵、鎳、鋅、鍶和鉬)的含量見表2。同一泌乳期，常量元素中含量最高的是鉀(16 281～16 922 mg·kg-1)，最低的是鎂(1 182～1 255 mg·kg-1)。微量元素含量最高的是鐵(70.5～74.8 mg·kg-1)，最低的是鉻(107～119 μg·kg-1)。經方差分析，12種礦物元素在泌乳期不同階段的含量差異不顯著(P>0.05)。表明在這3個泌乳階段中，泌乳期對牛奶中的礦物元素含量無影響。

表2 不同泌乳階段牛奶中12種礦物元素含量

2.2 不同產地牛奶礦物元素含量差異比較

圖1顯示4個地區牛奶樣品中12種礦物元素(鈉、鎂、鉀、鈣、鈦、鉻、錳、鐵、鎳、鋅、鍶和鉬)的含量。方差分析結果表明，除鉬外，其余11種礦物元素在4個地區的牛奶樣品中均存在差異。寧夏地區牛奶樣品中鈉、鎂、鉀、鈣、鐵及鎳6種礦物元素含量高于其他3個地區；內蒙古地區的牛奶樣品中鈦、鉻、錳和鋅含量顯著高于其他3個地區；陜西和內蒙古的牛奶樣品中鍶含量差異不顯著，但顯著高于其他2個地區。河北地區牛奶樣品中鈉、鎂、鉀、鈦、鉻、錳、鐵、鎳及鍶元素含量顯著低于其他3個地區；河北和寧夏地區牛奶樣品中鋅含量差異不顯著，但顯著低于其他2個地區；陜西和內蒙古地區樣品鈣含量差異不顯著，但顯著低于其他2個地區。4個地區牛奶中含量最高的常量元素是鉀(12 898～22 871 mg·kg-1)，最低的是鎂(879～1 610 mg·kg-1)；河北、寧夏及陜西3個地區牛奶含量最高的微量元素是鐵(62～84 mg·kg-1)，內蒙古地區牛奶含量最高的微量元素是鋅(75 mg·kg-1)，4個地區含量最低的微量元素是鉻(44～176 μg·kg-1)。

注：圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 基于化學計量學的牛奶產地判別分析

為區分不同產地的牛奶樣品，根據12種礦物元素含量進行偏最小二乘法分析，結果如圖2所示。4個地區的牛奶樣品分別聚類且彼此分離，說明通過礦物元素含量可以區分4個地區的牛奶樣品。4個地區牛奶樣品的分類及驗證結果見表3。總體正確分類和交叉驗證的準確率結果分別為95.8%和88.3%，說明利用礦物元素技術可以對這4個地區的牛奶樣品進行有效判別。用SIMCA 14.1軟件進一步對4個地區牛奶樣品進行分析，獲得分類礦物元素的重要性因子(圖3)。結果表明，牛奶中的鍶、鉻、鋅及錳4種礦物元素是具有較高貢獻的重要性因子(>1)，因此可以通過測定上述4種礦物元素識別河北、寧夏、陜西和內蒙古4個地區牛奶樣品的來源。

圖2 4個地區牛奶樣品的PLS-DA圖

圖3 4個地區牛奶樣品分類礦物元素的重要性因子

表3 4個地區牛奶樣本的分類和正確驗證結果

3 討論

在本研究中，選擇泌乳期的3個階段(早期:30～90 d，中期:120～180 d，末期:210～270 d)對牛奶中的12種礦物元素含量進行檢測，結果表明泌乳期不同階段中的牛奶礦物元素特征不具有差異性，與前人研究結果不同[18, 23]，但與Aumeistere等[24]報道的結果相似，這可能是由于泌乳期階段的劃分不同導致對礦物元素含量的影響不同，也可能是由于品種或物種差異造成的影響不同[25]。本研究中同一泌乳期含量最高的常量元素是鉀，最低的是鎂[18]，微量元素含量最高的是鐵，與孟慶翔[26-27]對肉牛飼料中的礦物元素含量研究結果一致。

在前期研究基礎上，本試驗研究了地區對牛奶中礦物元素含量的影響，結果表明不同產地可顯著影響牛奶中礦物元素含量，與高玎玲[28]及郭秀秀[29]的研究結果一致。本研究中寧夏地區牛奶樣品的鈉和鉀含量高于其他3個地區，這可能與奶牛的飼養方式有關[30]。雖然微量元素(鈦、鉻、錳、鐵、鎳、鋅、鍶及鉬)在體內的含量較低，但可通過奶牛的飲食與飲水轉移到牛奶中，而奶牛的飲食及飲水與當地的地質和土壤特征有關[31]。Chen等[32]對全國29個省、市及自治區22種土壤環境元素的背景值進行研究調查，發現寧夏地區土壤中鎂、鈣及鎳元素的含量明顯高于內蒙古、河北及陜西地區，與本研究中牛奶礦物元素在以上不同地區的含量結果一致。

雖然國內外基于礦物元素技術的乳制品產地溯源研究相對較多[33-35]，但大多集中于歐洲地區，且多數是針對奶酪進行產地溯源研究，關于牛奶的產地溯源研究相對較少[36]。本研究利用礦物元素技術并通過偏最小二乘判別分析法，對牛奶樣品進行產地溯源，結果顯示對4個地區有良好的區分效果，說明牛奶中礦物元素的含量具有獨特的產地環境特征，可作為牛奶產地溯源的重要變量參數。4個地區的牛奶樣品分類及判別結果顯示原始分類準確率為95.8%，交叉驗證準確率為88.3%，說明礦物元素技術可以有效鑒別牛奶樣品的來源。通過計算4個地區12種礦物元素的重要性因子篩選出鑒別牛奶樣品產地的關鍵重要性因子(鍶、鉻、鋅及錳)，這4種礦物元素反映了奶牛生長的地域地理狀態，其含量與4個地區奶牛生長的地域及飲水環境密切相關[37-39]，是識別河北、寧夏、陜西及內蒙古地區牛奶樣品的指示因子，代表著這4個牛奶產地的礦物指紋特性，尤其是飲水環境，4個地區飲用水中的鍶元素含量遠高于國家標準[37-38，40]，奶牛通過飲水影響牛奶中的鍶含量，與周雪巍[41]的研究結果一致。綜上所述，產地對乳品中的礦物元素含量有影響，且乳品中的礦物元素特征具有地域差異性，因此可以利用礦物元素技術結合化學計量學判別模型對牛奶進行產地溯源。

4 結論

本研究結果表明泌乳期3個階段(早期:30～90 d，中期:120～180 d，末期:210～270 d)不影響牛奶中12種礦物元素的含量，不同泌乳階段的劃分對礦物元素含量的影響不同，在同一泌乳階段中，鉀元素含量最高，鉻元素含量最低；而4個不同的地區(河北、寧夏、陜西及內蒙古)則影響牛奶中除鉬元素外的11種礦物元素(鈉、鎂、鉀、鈣、鈦、鉻、錳、鐵、鎳、鋅及鍶)含量。此外，本研究在牛奶的產地溯源研究中獲得了良好的交叉驗證結果，并得到了鍶、鉻、鋅和錳4個可以判別河北、寧夏、陜西及內蒙古牛奶樣品的關鍵重要性因子。說明利用礦物元素技術結合化學計量學判別模型對牛奶進行產地溯源是可行的，這為牛奶的礦物元素數據庫及產地溯源研究提供了有價值的參考數據，也為牛奶在泌乳期不同階段的研究提供了相關思路。