丁香-魚腥草-普魯蘭多糖復合涂膜對沙糖橘采后誘導抗性保鮮研究

黃嬌麗 鄧雅妮 易有金 朱樹清 鄧后勤 朱利紅

(1湖南農業大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410000；2百色學院農業與食品工程學院，廣西 百色 533000；3汝城縣繁華食品有限公司，湖南 郴州 424100；4汝城縣鑫利食品有限公司，湖南 郴州 424100)

柑橘(CitrusreticulataBlanco)為蕓香科柑橘亞科柑橘屬植物，產量居全國第二。因其分布廣、產量大、營養價值高，在我國農業經濟中占重要地位，且種植面積每年以4%的速度增長[1]。柑橘在貯運過程中易受侵染性病害影響，從而導致嚴重的經濟損失[2]。目前柑橘采后保鮮仍以化學防治保鮮為主[3]，常用的化學防治藥劑主要有抑霉唑、雙胍鹽和咪鮮胺等，而長期大量使用化學藥劑會造成環境污染，破壞生態平衡，提高病原菌耐藥性，導致保鮮效果降低[4]。因此研發新型高效、綠色安全的保鮮劑以替代化學防治藥劑已成為柑橘采后保鮮的研究熱點[5]。

生物防治主要是利用植物源提取物、生物保鮮劑(微生物代謝產物和拮抗菌)等對果實進行保鮮處理[6]。其中，植物源提取物保鮮劑以其顯著的效果和環保低毒的特點成為一種具有良好前景的果蔬采后病害防治手段[7-9]。近年來，植物提取物在柑橘類保鮮中的應用越來越多，研究較多的主要有植物精油和中草藥提取物保鮮劑。植物精油研究中發現牛至精油、丁香精油和桂皮精油對意大利青霉菌具有較好的抑制效果，經這三種植物精油處理后的柑橘貯藏至第4天仍無腐爛現象[10]。中草藥提取物保鮮劑研究中發現桂枝提取物對柑橘青霉菌和綠霉菌具有顯著的防治效果[9]。此外，白薇、零陵香、鴉膽子、藏青果、白藥子5種中草藥乙醇提取物對意大利青霉均有較好的抑制效果，其中白薇醇提取的抑制效果最強[11]。植物源提取物成分復雜，某些中草藥提取物之間還存在協同增效作用[12-13]，可通過抑制微生物、誘導果實相關抗性酶活性[11,14]、減少果實生理代謝來降低果實腐爛率[15]，維持果實品質，延長果實貯藏期。因此，研發復合中草藥提取物保鮮劑有利于完善植物油提取物貯藏保鮮技術。本研究以沙糖橘為研究對象，考察丁香、肉桂、魚腥草、廣藿香4種抑菌效果較好的中草藥對沙糖橘的防腐保鮮效果，以普魯蘭多糖為成膜劑，通過單因素和響應面試驗篩選出最佳的丁香-魚腥草普-魯蘭多糖復合涂膜沙糖橘保鮮劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙糖橘，采摘于長沙當地果園；丁香、肉桂、魚腥草、廣藿香，購于湖南省長沙市千金大藥房；普魯蘭多糖、殼聚糖(食品級)，鄭州市食代添驕化工產品有限公司。

2,6-二氯靛酚鈉鹽、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀(化學純)，國藥集團化學試劑有限公司；咪鮮胺(劑型：水乳劑，450 g·L-1)，河北省農藥化工有限公司。

1.2 儀器與設備

GZ-400-GSII智能人工氣候箱，韶關市廣智科技設備有限公司；LYT-330手持折光儀，上海淋譽公司；GY-1型果實硬度計，樂清市愛德堡儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 果實涂膜處理 選取無機械損傷、無病蟲害、大小均勻的沙糖橘，隨機分組，每組30個，設3組平行，各處理組分別在相應的涂膜液中浸泡1 min，自然晾干后置于溫度28℃、濕度75%的培養箱中儲存，每隔2 d對果實進行指標測定。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 中草藥水溶液種類篩選 分別稱取粉碎后過40目篩的丁香、肉桂、魚腥草和廣藿香4種中草藥材料各30 g，加入蒸餾水，紗布過濾，定容至300 mL，制成0.10 g·mL-1中草藥水溶液。將4種中藥材水溶液按照1.3.1的方法處理沙糖橘并設置空白對照組CK1，考察貯藏至第6天時不同中草藥水溶液對沙糖橘腐爛率的影響。

1.3.2.2 中草藥水提液種類篩選 中草藥水提液制備參照李濱丞[16]的方法，分別稱取粉碎后過40目篩的丁香、肉桂、魚腥草和廣藿香4種中草藥材料各30 g，置于燒杯中，加入150 mL蒸餾水，95℃水浴浸提20 min，兩層無菌紗布過濾，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液定容至300 mL，制成0.10 mg·mL-1的中草藥水提液。按照1.3.1的方法處理沙糖橘并設置空白對照組CK1，考察貯藏至第6天時不同中草藥水提液對沙糖橘腐爛率的影響。

1.3.2.3 同一中草藥不同濃度篩選 中草藥粉末溶液：將篩選出的保鮮效果較好的中草藥粉末溶液設置質量濃度梯度為0.05、0.10、0.15、0.20 mg·mL-1，按照1.3.1的方法處理沙糖橘并設置空白對照組CK1，考察貯藏至第6天時不同濃度中草藥粉末溶液對沙糖橘失重率和腐爛率的影響，篩選出的最適中草藥粉末溶液濃度。中草藥水提液：將篩選出的保鮮效果較好的中草藥水提液設置濃度梯度為0.10、0.20、0.40、0.50 mg·mL-1，按照1.3.1的方法處理沙糖橘并設置空白對照組CK1，考察貯藏至第6天時不同濃度水提液對沙糖橘腐爛率的影響，篩選出最適水提液濃度。

1.3.2.4 成膜劑不同濃度篩選 將篩選出的保鮮效果較好的成膜劑設置質量濃度梯度為0.50%、1.00%、1.50%、2.00%，按照1.3.1的方法處理沙糖橘并設置空白對照組CK1，考察貯藏至第6天時不同濃度成膜劑對沙糖橘失重率和腐爛率的影響，篩選出最適成膜濃度。

1.3.3 響應面優化試驗 在單因素試驗的基礎上，以綜合加權指標為響應值，根據響應面Box-Behnken設計原理，以普魯蘭多糖濃度(A)、丁香水提液濃度(B)、魚腥草粉末溶液濃度(C)3個因素為自變量，以綜合加權指標為響應值，進行三因素三水平的響應面優化試驗，確定最優組合。綜合加權指標參照湯曉雨[17]的試驗方法，按以下公式進行加權求和，得到綜合加權指標(Y)。

(1)。

1.3.4 復合涂膜保鮮劑對沙糖橘保鮮效果驗證試驗 根據篩選出的最優方案配制復合涂膜保鮮劑(保鮮劑組)，以陽性對照組(0.225 g·L-1咪鮮胺，咪鮮胺為有效成分450 g·L-1的水乳劑)、CK1(不做任何處理組)、CK2(蒸餾水處理組)為對照，按照1.3.1的方法處理沙糖橘，試驗10 d，每2 d測定一次沙糖橘品質相關指標，以評估沙糖橘的保鮮效果。

1.3.5 沙糖橘相關指標測定

1.3.5.1 腐爛率測定方法 采用計數法，按照公式(2)計算果實腐爛率：

(2)。

1.3.5.2 失重率測定方法 采用稱重法，按照公式(3)計算果實的失重率：

(3)。

1.3.5.3 生理生化指標測定 參照曹建康等[18]的方法測定。靜置法測定呼吸強度，手持折光儀測定可溶性固形物含量，2, 6-二氯酚靛酚滴定法測定抗壞血酸含量，氫氧化鈉溶液滴定法測定可滴定酸含量，硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定丙二醛含量，愈創木酚氧化法測定過氧化物酶(peroxidase, POD)活性，鄰苯二酚氧化法測定多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)活性。

1.3.5.4 感官評定 參照張偉清等[19]的評分標準，詳見表1。選10名食品專業研究生對貯藏至第10天的沙糖橘進行感官評價。

表1 沙糖橘感官評分標準

1.4 數據處理

運用 Design Expert 8.0.6.1軟件進行響應曲面圖繪制，Origin 2019軟件作圖，數據采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，采用Duncan多重比較進行顯著性分析，P<0.05表示組間差異顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 中草藥水溶液種類篩選 不同中草藥水溶液對沙糖橘腐爛率的影響見表2。貯藏至第6天時，4種中草藥水溶液組沙糖橘的腐爛率與CK1差異顯著，其中魚腥草水溶液處理的沙糖橘腐爛率最低，為50%，比CK1降低了30個百分點。因此選擇魚腥草水溶液進行不同濃度篩選。

表2 不同中草藥水溶液對沙糖橘腐爛率的影響

2.1.2 中草藥水提液種類篩選 不同中草藥水提液對沙糖橘腐爛率的影響見表3。貯藏至第6天時，4種中草藥水提液處理的沙糖橘腐爛率均與CK1差異顯著(P<0.05)，其中丁香水提液處理的沙糖橘腐爛率最低，為25%，比CK1降低了55個百分點。可見丁香水提液的保鮮效果較佳。

表3 不同中草藥水提液對沙糖橘腐爛率的影響

2.1.3 魚腥草水溶液濃度篩選 由表4可知，貯藏至第6天時，0.10 mg·mL-1魚腥草處理的沙糖橘失重率最低，為13.83%，與CK1相比顯著降低了12.9個百分點。0.10 mg·mL-1與0.05 mg·mL-1魚腥草處理的沙糖橘腐爛率均為55%，與CK1相比顯著降低了20個百分點。綜合沙糖橘失重率和腐爛率的結果，確定0.10 mg·mL-1魚腥草水溶液為最適濃度。

表4 4種不同質量濃度魚腥草水溶液對沙糖橘失重率和腐爛率的影響

2.1.4 丁香水提液濃度篩選 由表5可知，貯藏至第6天時，0.20 mg·mL-1丁香水提液處理的沙糖橘腐爛率最低，為40%，與CK1相比顯著降低了35個百分點。因此確定0.20 mg·mL-1丁香水提液為最適濃度。

表5 4種不同濃度丁香水提液對沙糖橘腐爛率的影響

2.1.5 普魯蘭多糖濃度篩選 由表6可知，貯藏至第6天時，1.0%普魯蘭多糖處理的沙糖橘失重率和腐爛率均為最低，失重率為15.75%，與CK1相比顯著降低了10.98個百分點；腐爛率為55%，與CK1相比顯著降低了20個百分點。綜合沙糖橘失重率和腐爛率的結果，確定1.0%普魯蘭多糖溶液為最適濃度。

表6 4種不同濃度普魯蘭多糖溶液對沙糖橘失重率和腐爛率的影響

2.2 響應面優化試驗結果

2.2.1 響應面優化試驗結果分析 根據Box-Behnken中心組合設計原理, 結合單因素試驗結果，以普魯蘭多糖濃度(A)、丁香水提液濃度(B)、魚腥草粉末溶液濃度(C)3個因素為自變量，以綜合加權指標為響應值，進行三因素三水平響應面分析試驗，結果見表7和表8。

表7 響應面試驗因素和水平設計表

表9 加權綜合值回歸方程方差分析

2.2.2 驗證試驗 由回歸方程得到復合保鮮劑最優組合為丁香水提液濃度0.24 mg·mL-1、普魯蘭多糖濃度1.06%、魚腥草水溶液濃度0.10 mg·mL-1，該組合下得出最大加權綜合理論值7.38。根據實際試驗情況，將該最優組合調整為丁香水提液濃度0.20 mg·mL-1、普魯蘭多糖濃度1.50%、魚腥草水溶液濃度0.10 mg·mL-1，對該試驗組進行驗證試驗，測得沙糖橘在28℃、相對濕度75%條件下貯藏6 d后加權綜合指標平均值為7.64，與理論預測值接近，說明該模型擬合性良好，驗證了模型的有效性。

2.3 復合涂膜保鮮劑對沙糖橘保鮮效果驗證試驗結果

2.3.1 復合涂膜保鮮劑對沙糖橘失重率和腐爛率的影響 如圖1-A所示，沙糖橘失重率隨貯藏時間的延長而上升，保鮮劑組和陽性對照組在整個貯藏期間均處于最低水平。貯藏至10 d時，CK1、CK2、陽性對照組、保鮮劑組的失重率分別為39.13%、37.28%、29.25%、28.24%，保鮮劑組與CK1、CK2和陽性對照組相比，分別降低了27.83、24.24、3.45個百分點，與CK1、CK2有顯著差異，與陽性對照組相比無顯著差異。

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

如圖1-B所示，各處理組從第4天開始出現腐爛，隨著貯藏時間的延長，腐爛率遞增，至第10天時，CK2的腐爛率高達55%，其次是CK1，為40%，陽性對照組和保鮮劑組腐爛率較低，分別為30%和25%，均與CK2差異顯著。

2.3.2 復合涂膜保鮮劑對沙糖橘感官評分的影響 由圖2可知，沙糖橘貯藏10 d后，保鮮劑組沙糖橘外觀和結構得分均顯著高于CK1和CK2，與陽性對照組無顯著差異，而氣味得分顯著低于CK1、CK2和陽性對照組，口感得分與CK1和CK2無顯著差異，而顯著低于陽性對照組。由圖3可知，保鮮劑組可有效降低沙糖橘的腐爛率，其外觀和結構結果與感官得分結果一致。

圖2 不同處理對沙糖橘貯藏至第10天時感官得分的影響

圖3 不同處理沙糖橘貯藏至第10天的外觀

2.3.3 復合涂膜保鮮劑對沙糖橘營養品質的影響 如圖4-A所示，保鮮劑組和陽性對照組與CK1和CK2相比，其可溶性固形物含量降低較緩慢，當貯藏至第10天時，保鮮劑組的可溶性固形物含量為10.72%，其次是陽性對照組、CK1和CK2。保鮮劑組和其他處理組存在顯著差異，說明保鮮劑組可有效抑制沙糖橘可溶性固形物的消耗。

圖4 不同處理對沙糖橘可溶性固形物含量(A)、VC(B)和可滴定酸含量(C)影響

由圖4-B可知，在貯藏過程中，各處理組果實的VC含量均呈現下降的趨勢，貯藏前2 d，各組果實VC含量差異較小，貯藏時間越長，各組VC含量差異逐漸增大，貯藏至第10天，保鮮劑組與陽性對照組VC含量差異不顯著，而與CK1差異顯著，保鮮劑組的VC含量為11.75 mg·100 g-1，與CK1、CK2相比，分別增加了57.72%和23.29%，與陽性對照組相比降低了13.79%。

由圖4-C可知，隨著貯藏時間的延長，各處理組的可滴定酸含量呈下降趨勢，當貯藏至第10天時，保鮮劑組的可滴定酸含量在4個處理組中最高，為0.50%，陽性對照組為0.43%，與CK1和CK2相比，保鮮劑組可滴定酸含量分別提高了0.15、0.16個百分點。保鮮劑組可顯著減緩可滴定酸含量的降低。

2.3.4 復合涂膜保鮮劑對沙糖橘衰老及防御相關酶的影響 如圖5-A所示，4組沙糖橘的呼吸強度均隨貯藏時間的延長而降低。保鮮劑組和陽性對照組在整個貯藏期間呼吸強度均低于CK1和CK2，且貯藏至第6天時，保鮮劑組與CK1和CK2差異顯著。貯藏至第10天時，保鮮劑組和陽性對照組無顯著差異，保鮮劑組的呼吸強度為10.47 mg·kg-1·h-1，與CK1、CK2和陽性對照組相比，分別降低了42.97%、36.62%和16.11%。

圖5 不同處理對沙糖橘呼吸強度(A)、丙二醛含量(B)、POD(C)和PPO(D)的影響

如圖5-B所示，在整個貯藏期間，所有處理組的丙二醛含量逐漸上升，保鮮劑組和陽性對照組沙糖橘的丙二醛含量在整個貯藏期間均處于較低水平，且從貯藏至第6天開始，與CK1和CK2差異顯著，保鮮劑組和陽性對照組差異不顯著。說明保鮮劑組和陽性對照組保鮮效果相似。

如圖5-C所示，在貯藏期間，POD活性先上升后下降。在貯藏第2天，出現第一個峰，各處理組之間沒有顯著差異。貯藏至第6天出現最大峰值，隨后各處理組的POD活性開始下降，CK1和CK2下降最明顯，而保鮮劑組和陽性對照組下降相對緩慢，第10天的 POD活性均比第0天高，且保鮮劑組和陽性對照組間無顯著差異，與CK1和CK2差異顯著。

如圖5-D所示，在貯藏過程中，沙糖橘果實的PPO活性呈現先上升后下降的趨勢，貯藏至第6天時出現最高峰。保鮮劑組和陽性對照組的PPO活性始終高于CK1和CK2，且除第8天外，顯著高于CK1和CK2。

3 討論

本研究發現魚腥草水溶液對沙糖橘腐爛率抑制效果較好，可能是由于魚腥草主要含有揮發油、黃酮類、生物堿、有機酸和多糖等[20]，而魚腥草多糖是魚腥草主要水溶性成分[21]，具有抗氧化、抗病毒、消炎抑菌等生物活性功能[22]。丁香水提液對沙糖橘保鮮效果較好，可能是由于丁香水提液中主要是丁香酚和黃酮類物質，其中丁香酚是丁香的主要有效成分[23]，對植物病原真菌具有較強的抑菌活性[24]。

水分流失會導致果實枯萎、干枯、褐變，改變果實的質地、味道，并加速衰老[25]。失重率是反映沙糖橘貯藏過程中水分和干物質減少的重要指標。本試驗發現，從貯藏第4天開始，丁香-魚腥草-普魯蘭多糖復合保鮮劑處理組的失重率顯著低于CK1和CK2，可能是由于表面涂膜有助于覆蓋果皮表面的微裂紋，形成一層保護膜，從而減少果實水分的蒸發[26]。沙糖橘由于果皮較薄，在貯藏過程中容易受到機械損傷，易受微生物侵染而腐爛。本研究發現保鮮劑組在貯藏至第10天時，其腐爛率在4個處理組中最低，為25%，可能是由于丁香魚腥草水溶液和提取液中含有丁香酚、丁香精油、生物堿、有機酸及多糖等生物活性成分，具有抑菌、抗氧化等功效[27]，可抵抗外界病菌的侵染，從而達到與陽性對照組相近的效果，這與Mahdi等[28]和盧山等[29]的研究一致。

在貯藏過程中，各處理組沙糖橘的可溶性固形物、VC含量和可滴定酸含量逐漸下降，貯藏至第10天，保鮮劑組處理的可溶性固形物和可滴定酸含量顯著高于CK1和CK2，VC含量與陽性對照組無顯著差異。可能是由于沙糖橘屬于非呼吸躍變型果實，在貯藏過程中直接進入衰老，可溶性糖等在代謝過程中被逐漸消耗而降低。VC是沙糖橘的重要營養物質之一，是一種水溶性抗氧化劑，可清除自由基，從而延緩果實的衰老[30]。Adriana等[31]研究發現沙糖橘貯藏16周之后，涂膜處理和商品涂蠟處理均對沙糖橘中VC含量無顯著影響，可能由于涂膜后在水果表面形成氣體屏障，形成相對的低O2和高CO2的環境，從而降低了VC的氧化。保鮮劑處理有效延緩了可滴定酸含量的降低，可能是由于該處理使沙糖橘的新陳代謝發生改變或者延緩了呼吸過程中有機酸的消耗，該結果與Baswal等[32]的研究結果相似。

各處理組沙糖橘的呼吸強度隨貯藏時間的延長而降低，在整個貯藏期間，保鮮劑組果實的呼吸強度始終低于CK1和CK2。原因可能是呼吸作用與CO2/O2濃度和細胞內呼吸酶的活性有關[33]，而保鮮劑的涂膜處理使果實表面環境形成較低的O2濃度和較高的CO2濃度，從而降低了呼吸速率。在本研究中，保鮮劑處理顯著提高了沙糖橘果實的POD活性，其PPO活性始終高于CK1和CK2。該結果與橙皮素處理可提高沙糖橘果皮PPO和POD活性的結果一致[34]。POD被認為是誘導植物和果實抗病性的關鍵酶之一，而PPO參與木質素的合成，促進細胞壁的木質化[35]，從而提高果實對病原菌的抗性。丙二醛是果蔬衰老過程中膜脂過氧化作用的主要產物之一，果蔬衰老時丙二醛含量增加，因此抑制丙二醛含量的積累可以延緩果蔬的衰老[36]。在整個貯藏期間，各處理組丙二醛含量隨時間增加而上升，從貯藏第6天開始，保鮮劑組丙二醛含量顯著低于CK1和CK2，而與陽性對照組差異不顯著，表明保鮮劑處理組有效抑制了沙糖橘丙二醛含量的積累。可見，保鮮劑處理組可有效延緩沙糖橘果實衰老，抑制其腐爛。

4 結論

本研究探討了丁香、肉桂、魚腥草、廣藿香4種中草藥的粉末溶液和水提液對沙糖橘的防腐保鮮效果，篩選出最佳的粉末溶液和水提液分別為0.10 mg·mL-1魚腥草和0.20 mg·mL-1丁香水提液，并以商業化學保鮮劑咪鮮胺處理組為陽性對照組，考察丁香-魚腥草-普魯蘭多糖復合涂膜對沙糖橘貯藏品質的影響。結果表明，最優復合保鮮劑組合為0.20 mg·mL-1丁香水提液、1.50%普魯蘭多糖和0.10 mg·mL-1魚腥草粉末溶液。保鮮劑組對沙糖橘保鮮效果與陽性對照組咪鮮胺接近，與CK1和CK2相比，保鮮劑處理組對沙糖橘貯藏期間的品質有一定的改善作用，可以降低沙糖橘的失重率和腐爛率，延緩沙糖橘可溶性固形物、VC含量和可滴定酸含量的降低，并抑制沙糖橘的呼吸強度，減少丙二醛含量的積累，保持較高的PPO和POD活性。本研究結果體現了中草藥提取物復合保鮮的優勢，但中草藥成分復雜，其中的協同效應機理還有待進一步研究。