貴州天名精化學成分及抗菌活性研究

陳 潔，王 丹，張 雄，彭明友，徐 冉,2，晏 英,2，王 穎,2*

1貴州醫科大學藥學院，貴陽 550025；2貴州醫科大學 貴州省化學合成藥物研發利用工程技術研究中心，貴陽 550004

菊科天名精屬(Carpesium)植物為多年生草本，全世界約有21種，其中少數種分布于歐亞大陸，大部分分布于亞洲中部，尤其是在我國的西南片區有豐富的植物資源，其中的天名精、煙管頭草和金挖耳已被列入中國法定藥用植物，貴州天名精(Carpesiumfaberi)因其止血、抗寄生蟲、抗炎和解毒特性，長期以來被用作民間藥物[1,2]。文獻報道已從天名精屬植物中至少分離得到277個化合物，結構類型包括萜類，黃酮，酚類，甾體等，其中從貴州天名精中分離得到37個化合物，其中倍半萜是其主要活性成分[2]。藥理研究顯示倍半萜類化合物具有抗腫瘤、抗瘧原蟲、抗炎、抗菌等多種生物活性[3]。近年來對于貴州天名精的活性報道主要是抗腫瘤活性[4-6]以及抗炎活性[7,8]，尚未對其抗菌活性進行報道。為促進天名精植物資源的綜合開發與利用，本研究對采自貴州凱里的天名精全草開展化學成分研究，并對所得化合物進行抗菌活性測試。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

旋轉蒸發儀(東京理化，N-1300D-WD)；Bruker AV-600 MHz核磁共振儀(德國布魯克公司)；四甲基硅烷(TMS)為內標；Bruker HTC/Esquire 質譜儀(德國布魯克公司)；高效液相色譜儀為Agilent 1200型(美國安捷倫科技司)；色譜柱Waters sunfire C18(10 mm × 150 mm，4.6 mm× 250 mm)(沃特世公司)；BP211D電子天平(Sartorouius公司)；UV-2700型紫外可見分光光度計(島津儀器有限公司)；FTIR-650傅里葉變換紅外光譜儀(天津港東科技發展股份有限公司)；超低溫保存箱(海爾醫療公司)；高壓滅菌鍋(上海博訊實業有限公司)；電熱恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)；恒溫振蕩培養箱(上海躍進醫療器械有限公司)；96孔一次性細胞培養板(耐思生命科技有限公司)；移液槍(Eppendorf公司)。二甲基亞砜(索萊寶科技有限公司)；MHB培養基(北京奧博星生物技術公司)；Sephadex LH-20(三菱公司)；C18反相硅膠(日本YMC公司)；正相硅膠和薄層色譜板(青島海洋化工廠)；核磁用氘代試劑(美國CIL氘代試劑)；液相用水(娃哈哈純凈水20181109)；色譜級甲醇、乙腈(科密歐試劑公司)；化學實驗用溶劑為工業重蒸溶劑，顯色劑為8%的硫酸乙醇溶液。

1.2 實驗材料

菌株：大腸桿菌(Escherichiacoli)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、銅綠假單胞桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，均購于上海中科康泰生物有限公司，保存于-80 ℃。

樣品采自貴省州凱里市，經過貴陽中醫學院孫慶文老師鑒定為貴州天名精(Carpesiumfaberi)，憑證標本(TMJ201909)保存于貴州醫科大學藥學實驗室。

1.3 實驗方法

1.3.1 化合物的提取與分離

將貴州天名精全草30 kg切碎后，以乙醇在室溫條件下浸泡48 h后提取，每次提取時間為3 h，所得提取液在55 ℃條件下用旋轉蒸發儀濃縮，將所得浸膏放置于通風櫥中，揮干至無醇味，所得浸膏大約12 kg。將上述所得浸膏加水充分混懸后用乙酸乙酯萃取3次。萃取液在旋轉蒸發儀(溫度：55 ℃)上濃縮。所得萃取物放置于通風櫥中，待溶劑揮干，最后稱取浸膏的重量為：乙酸乙酯部分重1.5 kg。取乙酸乙酯部位浸膏，用乙酸乙酯充分溶解后，加入適量正相硅膠(40～80目)拌樣。正相硅膠(100～200目)用石油醚濕法裝柱，邊加邊敲打柱體，以確保裝柱結實無氣泡，反復利用石油醚沖洗，待液面降至與硅膠面基本相平，采用干法上樣，以石油醚-乙酸乙酯(50∶1→0∶1)梯度洗脫樣品，經TLC檢測，合并相似流分，共得10個組分，記為Fr1～Fr10。

其中Fr5(67.5 g)經過MCI(甲醇-水50%→100%)得到8個亞餾分，記為Fr5-1～Fr5-8，其中Fr5-3(1 g)經過反相(甲醇-水40%→100%)，得到6個亞餾分，記為Fr5-3a～Fr5-3f，其中Fr5-3e再經過制備型HPLC(流動相為98%甲醇-水，流速3 mL/min，保留時間23 min)得到化合物11(4 mg)；Fr5-5(10 g)經過反相柱(甲醇-水40%→100%)得到8個亞餾分，記為Fr55-1～Fr55-8，其中Fr55-5經過凝膠柱層析(甲醇)再經過硅膠柱層析(二氯甲烷∶甲醇1∶0→100∶1)，得到化合物13(4.6 mg)；Fr55-6經過凝膠柱層析(甲醇)，再經過硅膠柱層析(石油醚∶乙酸乙酯35∶1→0∶1)得到6個亞餾分，記為Fr55-6a～Fr55-6f，其中Fr55-6d經過制備型HPLC(流動相為70%甲醇-水，流速3 mL/min，保留時間25.6 min)得到化合物10(3 mg)；Fr55-6b經過制備型HPLC(流動相為100%甲醇，流速3 mL/min，保留時間27.2 min)得到化合物9(5.5 mg)；Fr55-7經過凝膠柱層析(甲醇)，再經過硅膠柱層析(石油醚∶丙酮20∶1→0∶1)，得到3個亞餾分Fr55-7a～Fr55-7c，其中Fr55-7b經過制備型HPLC(流動相為98%甲醇-水，流速3 mL/min，保留時間21 min)得到化合物14(3 mg)；Fr55-7a經過制備型HPLC(流動相為100%甲醇-水，流速3 mL/min，保留時間22 min)得到化合物8(4.9 mg)；Fr55-8經過2次硅膠柱(石油醚：乙酸乙酯40∶1→0∶1)，得到化合物12(4.8 mg)。

Fr7(78 g)經過MCI(甲醇-水20%→100%)得到9個亞餾分，記為Fr7-1～Fr7-9，其中Fr7-2經過反相柱層析(甲醇-水10%→50%)得到5個亞餾分，記為Fr7-2-1～Fr7-2-5，其中Fr7-2-3經硅膠柱層析(5∶1→0∶1)得到5個亞餾分記為Fr7-2-3a～Fr7-2-3e，其中Fr7-2-3b經過制備型HPLC(流動相為30%甲醇-水，流速3 mL/min，保留時間15 min)得到化合物7(10.9 mg)；Fr7-2-3c經過制備型HPLC(流動相為30%甲醇-水，流速2.5 mL/min，保留時間18.2 min、24 min)，得到化合物2(6.8 mg)、化合物3(4.4 mg)；Fr7-4經過反相柱層析(甲醇-水10%→60%)得到10個亞餾分，記為Fr7-4-1～Fr7-4-10，其中Fr7-4-3、Fr7-4-6用甲醇重結晶得到化合物5(10 mg)、化合物1(20 mg)；Fr7-4-8經過硅膠柱層析(二氯甲烷∶甲醇200∶1→0∶1)再經過制備型HPLC(流動相為40%甲醇-水，流速2.5 mL/min，保留時間26 min)，得到化合物4(5.1 mg)；Fr7-7用甲醇重結晶得到化合物6(24 mg)。

1.3.2 化合物1單晶結構的測定

將化合物1在1 mL液相瓶中用甲醇溶解，瓶口用塑料膜覆蓋，并在膜上扎2個小孔，室溫揮發，得到若干晶體。對于單晶分析，選擇尺寸為0.40 mm × 0.07 mm × 0.04 mm的晶體。所有衍射數據均在裝備銅靶的Bruker Smart Apex CCD diffractometer衍射儀上獲得。

1.3.3 化合物活性篩選

1.3.3.1 樣品供試液制備

精確稱取一定量的化合物溶于二甲基亞砜中，配制成濃度為15.36 mg/mL的溶液，低溫避光保存備用。

1.3.3.2 菌株活化

MHB液體培養基：稱取12 g固體培養基，加蒸餾水1 000 mL，加熱使培養基完全溶解，于高壓滅菌鍋中，121 ℃滅菌30 min。

將細菌接種在MHB液體培養基中，于37 ℃、130 r/min條件下活化培養24 h；利用平板劃線法蘸取活化菌液于固體培養基，37 ℃靜置培養12～24 h，獲得單個菌落。用接種環挑取單菌落于MHB液體培養基中，37 ℃、130 r/min條件下培養24 h，制得菌懸液，用MHB培養液將菌懸液濃度稀釋至1×106～1×107CFU/mL備用。

1.3.3.3 最小抑菌濃度(MIC)的測定

使用無菌96孔一次性細胞培養板，做好標記后，在1號孔中加入300 μL培養基溶液為空白對照，在2號孔中加入10 μL DMSO，140 μL培養基溶液，在3號孔中加入10 μL硫酸慶大霉素，140 μL培養基溶液，5～12號孔預先加入150 μL培養基溶液，4號孔加入290 μL培養基溶液，再加入10 μL樣品溶液混勻后吸取150 μL至5號孔，采用二倍稀釋法依次進行稀釋至12號孔，每個梯度重復3次；2～12孔均加入100 μL，1×106～107CFU/mL菌懸液，接種后，置于37 ℃搖床培養24 h后取出觀察。如小孔內澄清即視為細菌生長受到了抑制，澄清小孔中所對應的最低藥物濃度為對該菌的最低抑菌濃度。實驗方法參考Wang等[9]的研究。

2 實驗結果

2.1 結構鑒定

化合物1的晶體數據：C15H20O4，M = 264.31，晶胞參數：a= 6.462 1(2)nm，b= 6.462 1(2)nm，c= 62.496(2)nm，α= 90°，β= 90°，γ= 90°；晶胞體積：V= 2 609.75(18)nm3；晶胞內分子數：Z= 8；T= 100(2)K，空間群P41 212，μ(Cu Kα)= 0.790 mm-1，共收集24 445個衍射點，對其中2 548個獨立點(Rint=0.027 9)進行分析。R1=0.033 5，wR2=0.089 8，Flack 參數為0.02(2)，如圖2所示。

圖2 化合物1的單晶X射線衍射結構

2.2 最小抑菌濃度(MIC)的測定結果

評估了化合物1～14對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、枯草芽孢菌和白色念珠菌的抑菌活性。結果表明，化合物1對枯草芽孢桿菌表現出微弱抑菌活性，化合物1的MIC值為256 μg/mL，化合物10和化合物6對白色念珠菌顯示出弱活性，化合物10的MIC值為128 μg/mL，化合物6的MIC值為128 μg/mL，其余化合物則未顯示抗菌活性。

3 結論

利用多種色譜方法，從黔產天名精中分離鑒定得到14個化合物，如圖1所示，包括倍半萜、二萜、甾體類等成分，其中化合物2、7～14為首次從該植物中得到。針對分離得到的化合物進行抗菌活性篩選。采用二倍稀釋法，測定化合物對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、枯草芽孢菌和白色念珠菌的抑菌活性，使用處于對數生長期的菌種，所有樣品均使用DMSO溶解配制成15.36 mg/mL的藥液。活性測試結果顯示，抗菌活性測試表明，化合物1對枯草芽孢桿菌有微弱抑菌活性，化合物1的MIC值為256 μg/mL，化合物10、化合物6對白色念珠菌顯示出弱活性，化合物10的MIC值為128 μg/mL，化合物6的MIC值為128 μg/mL，其余化合物則未顯示出抗菌活性。本研究成果豐富了貴州天名精中的化學成分及生物活性內容，為其進一步的研究開發提供參考資料。

圖1 化合物1～14化學結構